学位论文膨胀石墨在植物组织培养中的.docx
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学位论文膨胀石墨在植物组织培养中的
膨胀石墨在植物组织培养中的
应用研究
摘要
摘要:
本设计是为了研究膨胀石墨在植物组织培养中的应用。
以H2SO4和HNO3的混酸作为酸化剂,KMnO4做氧化剂,采用化学氧化的方法制备可膨胀石墨,在1000℃的温度下膨化,制得膨胀石墨。
通过将不同粒度(+32目。
+100目,-100~+160目)和不同含硫量的膨胀石墨加入到植物组织培养的培养基中,通过对照实验和正交实验法,将不同粒度和含硫量的膨胀石墨加入到培养基中,并在不同的培养基条件(膨胀石墨粒度、含硫量、膨胀石墨用量、生长素浓度)接种相同的植物组织,根据对照实验方案,在相同的培养基和组织在不同的条件(理想条件和自然条件)下培养,在培养一个月之后的结果,来判断膨胀石墨在组织培养中的作用和效果。
通过实验每毫升培养基中加入0.5~2.0毫克膨胀石墨效果较好。
发现在苏铁组织培养中,具有很好的抑制细菌生长的作用,未加石墨的染菌几率是加入石墨的5倍。
并能促进苏铁愈伤组织的形成和抑制褐化现象的发生,加入膨胀石墨的有18.5%形成愈伤组织,而未加石墨的全部染菌。
在月季的组织培养中,对月季的成活率和生长有明显的促进作用,加入石墨的发芽率是未加石墨发芽率的3倍,并且加入石墨后的月季组织生长较好的占65%以上,是未加石墨的5倍。
因此,由以上两种植物组织培养的实验结果证明,膨胀石墨可以应用到植物组织培养中。
并且对植物组织培养是有利的,不仅具有良好的抑制细菌生长的作用和抑制褐化现象的发生,而且在一些技术比较成熟的植物组织培养中(如月季)对成活率和生长的促进作用较明显。
关键词:
细鳞片石墨;膨胀石墨;应用;植物组织;组织培养;细胞;苏铁;月季
ABSTRACT
Thisdesignismadetoresearchtheuseofexpansiongraphiteinthecultureofplanttissue.Wecangetexpansiongraphiteunder1000℃byusingthemixtureofH2SO4ofHNO3asacide,KMnO4asoxidizingagentandusingchemicaloxidization.throughputtingdifferentsize(+32mu,+100mu,-100~+160mu)andsulphurcontenexpomisiongraphiteintoculturemediumofplanttissue;throughcontrastingexperimentandperpendicularexperiment,andputdifferentsizeandsulphurcontentexpansiongraphiteintoculturemedium;andundertheconditionsofdifferentculturemedium(thesizeofexpansiongraphite,sulphurcontent,thevolumeofexpansiongraphite,growthhrmoneconcentration)tomoculatethesameplanttissue.Acordingtotheconditionnaturalcondition,andintheprocessofculturing.Weshouldobserveandwritedowntherelativetada,andwecanjudgetheeffectandpointofexpansiongraphiteusedinthecultureoftissue,throughtheresultofonemonth’sofculture.
Throughtheexperiments,Wefindthatistosevyweshouldput0.5~2.0mgexpansiongraphiteintopermilliliterculturemedium.Wefoundthatinthecycadtissue,itcanrestrainthegrowthofgermwell,andtheculturewithoutgraphiteistimethemtheculturewithit.Andthegraphitecanpromotetheformingofcallustissueofcycadandrestraintheoccuringofbrownappear,andtheresultof18.5%plantwhichcanfromthecallustissuewithexpansiongraphite,butalltheplantswereinfectedwithgernwithoutexpansiongraphite.Itpromotsthesurvivalandgrowthofthechineseroseobliviouslyinthetissueculture,andthegerminationpercentagewithgraphiteis3timesofthatwithoutgraphite.AndtheChineserosewhichgrowwelltakeabout65%whichis5timeofthatwithoutgraphite.Therefore,itprovidedthatexpansiongraphitecanusedinthetissuecultureofplant.Anditisrestrainthephenominebecomeworse,andwiththematuretechnologytissuecultureofplantpromotthesurvivalandgrowthmoreoblivious.
Keywords:
smallsquamagraphite;expansiongraphite;use;planttissue;
tissueculture;cell;cycad;chineserose
目录
摘要………………………………………………………………………………………
(1)
ABSTRACT……………………………………………………………………………
(2)
1绪论……………………………………………………………………………………
(1)
1.1课题背景……………………………………………………………………………
(1)
1.2植物组织培养的一般概念…………………………………………………………
(1)
1.3植物组织培养的发展简史…………………………………………………………
(1)
1.4植物组织培养的基本技术…………………………………………………………
(2)
1.4.1基本设备………………………………………………………………………
(2)
1.4.2培养基…………………………………………………………………………
(2)
1.4.3外植体…………………………………………………………………………(4)
1.4.4培养条件………………………………………………………………………(4)
1.5植物组织培养的理论基础…………………………………………………………(4)
1.6植物组织培养的基本方法…………………………………………………………(4)
1.7石墨与膨胀石墨基本知识…………………………………………………………(6)
1.6.1石墨概述………………………………………………………………………(6)
1.6.2膨胀石墨………………………………………………………………………(6)
1.8膨胀石墨制备方法…………………………………………………………………(6)
1.7.1化学氧化法……………………………………………………………………(7)
1.7.2电化学法………………………………………………………………………(7)
1.7.3超声氧化法……………………………………………………………………(7)
1.7.4气象扩散法……………………………………………………………………(7)
1.7.5熔盐法…………………………………………………………………………(7)
1.9膨胀石墨的性质……………………………………………………………………(9)
2研究的目的、内容、意义及价值…………………………………………………(10)
2.1研究的目的………………………………………………………………………(10)
2.2研究的主要内容…………………………………………………………………(10)
2.3研究的意义及价值………………………………………………………………(10)
2.4可能的突破与创新………………………………………………………………(12)
3国内外研究现状……………………………………………………………………(13)
3.1膨胀石墨研究现状………………………………………………………………(13)
3.1.1膨胀石墨的制备研究………………………………………………………(13)
3.1.2膨胀石墨的开发应用………………………………………………………(13)
3.2植物组织培养研究现状…………………………………………………………(14)
3.2.1植物组织培养的研究情况…………………………………………………(14)
3.2.2植物组织培养的应用情况…………………………………………………(17)
4材料与方法…………………………………………………………………………(22)
4.1实验目的…………………………………………………………………………(22)
4.2实验材料、仪器设备、试剂药品…………………………………………………(22)
4.2.1实验材料……………………………………………………………………(22)
4.2.2仪器设备……………………………………………………………………(22)
4.2.3试剂药品……………………………………………………………………(22)
4.3实验原理…………………………………………………………………………(22)
4.4实验内容…………………………………………………………………………(23)
4.5实验方案…………………………………………………………………………(23)
4.5.1膨胀石墨制备方案…………………………………………………………(23)
4.5.2组织培养方案………………………………………………………………(23)
4.6试验过程…………………………………………………………………………(26)
4.6.1膨胀石墨的制备……………………………………………………………(26)
4.6.2膨胀石墨性质的研究………………………………………………………(29)
4.6.3培养基的配制………………………………………………………………(30)
4.6.4组织培养材料的采集………………………………………………………(32)
4.6.5组织培养步骤………………………………………………………………(33)
4.6.6培养条件……………………………………………………………………(36)
4.7观察、分析与测试…………………………………………………………………(36)
4.7.1苏铁组织培养………………………………………………………………(36)
4.7.2月季组织培养………………………………………………………………(37)
4.8试验结果…………………………………………………………………………(37)
4.8.1苏铁培养结果………………………………………………………………(37)
4.8.2月季培养结果………………………………………………………………(38)
5结果与讨论…………………………………………………………………………(40)
5.2石墨的加入情况…………………………………………………………………(40)
5.2膨胀石墨的抑菌效果……………………………………………………………(40)
5.3膨胀石墨抑制褐化效果…………………………………………………………(41)
5.4膨胀石墨促进生长效果作用……………………………………………………(41)
5.5膨胀石墨对形成愈伤组织的作用………………………………………………(41)
6结果与评价…………………………………………………………………………(42)
6.1结果评价方法……………………………………………………………………(42)
6.2结果评价标准……………………………………………………………………(42)
7结论与展望…………………………………………………………………………(43)
7.1结论………………………………………………………………………………(43)
7.2展望………………………………………………………………………………(44)
参考文献…………………………………………………………………………………(45)
致谢……………………………………………………………………………………(49)
1绪论
1.1课题背景
本课题是在我校细鳞片石墨研究较深入,以及攀枝花市细鳞片石墨深加工实验室建立,进一步开发利用攀枝花细鳞片石墨资源,结合当前植物组织培养的一些实际情况,将无机非金属材料与生物科学结合的一个交叉研究课题,目的在于:
第一、通过实验证明和找出膨胀石墨在植物组织培养中的应用情况;第二、通过加入膨胀石墨是否可以解决目前一些较难培养的植物(如,苏铁、其它珍稀的药用植物等)。
第三、拓宽膨胀石墨的应用领域。
1.2植物组织培养的一般概念
植物组织培养又叫植物细胞培养。
植物组织培养按其原始意义,就是指愈伤组织培养。
但发展至今其范围日益扩大,已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养。
因此,拥有几种不同水平的培养技术,即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质体的培养技术。
它们的涵义是[1]:
(1)、植株培养:
指以具备完整植株形态的材料(如幼苗和较大的植株)为外植体的无菌培养。
(2)、胚胎培养:
指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。
(3)、器官培养:
指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养,如根的根尖和切段,茎的茎尖、茎节和切段,叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶,花器的花瓣、雄蕊(花药、花丝)、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。
(4)、组织培养:
指以分离出植物各部位的组织(如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等),或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。
这是狭义的组织培养。
(5)、细胞培养:
指以单个的游离细胞(如用果酸酶从组织中分离的体细胞,或花粉细胞、卵细胞)为接种体的离体无菌培养。
(6)、原生质体培养:
指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。
1.3植物组织培养的发展简史
植物组织培养从提出设想到实践成功,经历了漫长的历程。
德国的植物学家和植物胚胎学家哈伯兰特和汉宁(Hanning)等人,用植物的叶、茎、根、花的小块组织或细胞,进行过离体组织或细胞的无菌培养试验。
虽然他们取得的进展很小,然而这些探索性的试验,为后人提供了许多值得借鉴的经验[4]。
1937年,美国科学家怀特(White)配制出了植物组织培养用的培养基,并且认识到维生素和植物激素在植物组织培养中的重要作用。
他和当时的一些科学家,用烟草的茎段形成层细胞和胡萝卜根的小块组织,在人工培养条件下,成功地诱导出了愈伤组织。
但是他们未能从愈伤组织中诱导出芽和根[4]。
1948年,我国植物生理学家崔徵和美国科学家合作,用不同种类和比例的植物激素处理离体培养的烟草茎段和髓,发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。
植物组织培养取得突破性进展是在1958年,美国植物学家斯图尔德(F1C1Steward)等人,培养胡萝卜韧皮部的细胞,得到了完整植株,并且这一植株能够开花结实[4]。
20世纪60年代以后,植物组织培养技术开始在生产上应用,并且逐渐朝着产业化方向发展。
随着科学技术的发展,植物组织培养技术将日益完善和普及,成为现代农业及多种行业重要的技术手段[4]。
1.4植物组织培养的基本技术
植物组织培养是一相技术性较强的工作,为了确保组织培养工作的顺利进行,必须具备最基本的实验条件,并要熟练掌握培养的基本技术,包括培养基的配制、无菌技术、环境条件控制等[6]。
1.4.1基本设备
植物组织培养同微生物培养相比,培养时间长,短则一两个月,长则可达几年,因此在操作过程和培养过程中,最重要的是防止细菌等微生物的感染,无菌设备非常重要。
包括无菌室、超净工作台、其它培养过程中所用到的玻璃器皿和用具(包括:
培养基配制用具、培养用具、接种用具、灭菌用具等)、培养过程中检测等仪器(包括:
天平、酸度计、搅拌器、冰箱、培养箱、显微镜等),以及培养室。
1.4.2培养基
培养基是植物组织培养中最主要的部分,除了陪阿姨能够材料本身因素外,培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长发育,应根据培养材料的种类和培养部位选取适宜的培养基。
植物组织培养常用的培养基有MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基等。
其中MS培养基广泛用于多种植物的各类组织培养。
无论是那类培养基,起组成都包含以下几部分:
水、无机物、有机物、植物激素、培养材料的支持物、抗生素物质、抗氧物质、其它物质。
(1)MS培养基的特点
MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计出来的,无机盐和离子浓度较高,为较稳定的离子平衡溶液。
其养分的数量和比例比较合适,可满足植物细胞的营养和生理需要。
它的硝酸盐(钾、铵)的含景较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。
LS和RM培养基是由它演变而来[6]。
(2)MS培养基的成分
植物组织培养过程中,外植休生长所必需的营养和生长因子,主要是由培养基供应的。
因此培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。
所有这些物质,可概括为5大类:
①无机营养物有十三种是植物必需的元素:
氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、硫(S)、铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(zn)、钼(Mo)、氯(C1)。
前六种属大量元素,后7种属微量元素。
培养基的各种盐类中均含有上述这些元素。
碘虽不是植物生长的必要元素,但几乎所有组织培养基中都含有碘元素,有些培养基还加入钻(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、铍(Be),甚至铝(Al)等元素。
无机氮可以两种形式供应,即硝酸态氮和铵态氮。
有些培养基以硝态氮为主,另一些以铵态氮为主,多数二者兼而有之。
铁往往以无机铁供应,如FeSO4。
为了防止沉淀,致使利用率下降,故目前皆用螯合铁,即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)配成。
②有机物质主要有两类:
一类是作为有机营养物质,为植物细胞提供碳(C)、氢(H)、氧(O)和氮(N)等必要元素,如糖类(蔗糖、葡萄糖和果搪)、氨基酸及其酰胺类(如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺);另一类是—些生理活性物质,在植物代谢中起一定作用,如硫胺素(B1)、吡哆醇(B6)、烟酸、生物素、肌醇、单核苷酸及其碱基(如腺嘌呤等)。
③植物生长刺激物质主要加入植物天然的五类激索物质及其人工合成的类似生长激素物质,如生长素中常用的有吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2,4—二氯苯氧乙酸(2,4—D)、吲哚丁酸(IBA);细胞分裂素中常用的有激动素(6—吠喃氨基膘吟、KT、KN、KIN),6—苄基氨基嘌呤(BA、BAP),玉米素(ZT、ZN、ZEN);赤霉素类(GA)中常用的有赤霉酸(CA3);脱落素类中常用的有脱落酸(ABA);乙烯类中常用的有乙烯和乙烯利。
④其他附加物这些物质不是植物细胞生长所必需的,但对细胞生长有益。
如琼脂是固体培养基的必要成分,活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度,对细胞生长有利。
液体培养适中加入Ficoll和Agarose,可改善培养细胞的供氧状况。
⑤其他对生长有益的未知复合成分常用的为植物的天然汁液,如椰乳、酵母抽提物、荸荠汁、西瓜水、苹果汁、生梨汁等等。
它们的作用是供给一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等。
1.4.3外植体
植物组织培养的成败与培养基的组分有关,另一个重要因素就是外植体本身,即有活体植物上切取下来,用以进行离体培养的那部分组织或器官。
为了使外植体适于在离体培养条件下生长,使组织培养工作顺利进行,有必要对外植体进行选择与处理。
外植体的选择应根据培养的目的和要求进行选取。
外植体选取后必须对外植体进行消毒处理后方可进行培养。
1.4.4培养条件
外植体接种后,必须置于适宜的条件下进行培养,一般包括温度、光照、通气和湿度等。
培养时应根据所培养植株的生理生化特性选择适宜的培养条件。
1.5植物组织培养的理论基础
组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞,在人工预知的控制条件下,于含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中,使其生长、分化形成完整植株的过程。
组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性。
即植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息,在离体培养情况下,这些信息可以表达,产生出完整植株。
一是由分生组织直接分生芽而达到快速繁殖的目的;二是由分生组织形成愈伤组织,经过分化实现细胞的全能性;三是游离细胞或原生质体形成胚状体,由胚状体直接重建完整植株,或制成人工种子后再重建植株[1]。
1.6植物组织培养的基本方法
植物组织培养的方法多种多样,按照培养基的不同可以分为固体培养和液体培养。
其中液体培养又可以按照培养方式的不同分为液体薄层静止培养和液体悬浮培养[3]。
固体培养是指细胞在含有琼脂的固体培养基上生长繁殖的培养过程。
植物细胞培养所使用的固体培养基除了含有植物细胞生长繁殖所需的各种组分以外,还含有0.7%~0.8%的琼脂,培养基呈半固体状态。
固体培养在愈伤组织的诱导和继代培养,细胞和小细胞团的筛选、诱变,单细胞培养和原生质体培养等方面广泛使用。
液体薄层静止培养是将接种有单细胞的少量液体培养基置于培养皿中,形成一薄层,在静止条件下进行培养,使细胞生长繁殖的培养过程。
在单细胞培养中使用。
液体悬浮培养是指细胞悬浮在液体培养基中进行培养的过程。
植物细胞生产次级代谢物的过程,以及通过植物细胞进行生物转化将外源底物转化为所需产物的过程,通常是在生物反
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