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miR22对卵巢癌浸润转移的抑制作用及调控机制分析
miR22对卵巢癌浸润转移的抑制作用及调控机制分析
前言
卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤,其死亡率居妇科恶性肿瘤之首。
其主要原因是卵巢癌早期症状隐匿,70%初诊时己是发生浸润转移的晚期阶段。
浸润转移是影响卵巢癌患者预后的重要因素[l】。
因此,探讨卵巢癌浸润转移的相关机制有着重要的临床意义。
近年来,随着表观遗传学尤其是非编码RNA的研究进展,微小RNA(microRNA,mi胭A)的作用越来越受到重视。
微小RNA(miRNA)是动植物基因组中广泛存在的一类非编码单链小分子RNA,在转录后水平以完全或非完全互补的方式与其靶mRNA相结合,调节靶基因表达,影响生物体性状。
研究发现,
miRNA参与生命过程中一系列重要进程,并与人类多种疾病密切相关,包括肿瘤[2」。
研究发现,在人类己知的500多种miRNA中,有50%位于脆弱基因位点或
肿瘤形成相关区域【2]。
这些miRNA通过对目标基因的转录后调控,发挥抑癌基因或促癌基因的作用,参与肿瘤的发生、发展13,4]。
另有学者采用miRNA芯片技术分析正常组织和肿瘤组织间m1RNA表达谱差异,发现一些特异的miRNA可以作为肿瘤诊断及预后的指标「5,61。
近年来,越来越多的证据表明miRNA与肿瘤的浸润转移也密切相关,包括卵巢癌[7一12]。
miRNA与卵巢癌浸润转移
目前,有关miRNA与卵巢癌侵袭转移的相关研究多集中于探讨单个m1RNA
功能及机制〔9一12】。
研究发现,rniR一34,miR一125a及miR一185具有抑制卵巢癌侵
袭转移的功能,miR一21则能增强卵巢癌侵袭能力〔9一12]。
其中,miR一34,miR-185,
miR一21主要影响卵巢癌细胞的浸润和迁移能力,而miR一125a主要影响卵巢癌细胞上皮一间充质转变(epithelial一to一mesenehymal,EMT)过程[9一12]。
且这些miRNA
均通过其下游特定的靶基因发挥作用。
如miR一21主要通过抑制PTEN的表达发挥促进卵巢癌细胞增殖、浸润及迁移能力,而miR一185则通过下调SIXI的表达抑制卵巢癌细胞的浸润迁移能力【n,12]。
miR一22与肿瘤
既往文献报道,miR一22在多种肿瘤中存在异常表达,参与肿瘤发生发展的多
个过程,包括细胞增殖、凋亡、迁移及对细胞周期的调控【13一23」。
而在卵巢癌中,对miR一22的研究目前仅局限在表达检测,尚无功能研究报道。
细胞水平,卵巢癌细胞中miR一22的表达水平明显低于正常卵巢上皮细胞;组织水平,卵巢癌组织中
miR一22的表达水平显著低于正常卵巢组织,且随着卵巢癌的进展,其表达水平逐渐降低tlg一22]。
我们的前期芯片结果也显示,miR一22在高侵袭力的卵巢癌
SKOV一3iP细胞中呈低表达,我们拟在此基础上首先进一步确认miR一22与卵巢癌细胞浸润转移的相关性,进而对其进行功能研究及靶基因水平的筛选。
第一部分:
Real一timeRl下pcR验证miR一22在两对不同侵袭能力的卵巢癌细胞株
SKoV-3/SKoV-3ip细胞、Ho一8910肛O一sgloPM细胞中的差异表达
材料与方法一、材料
(一)细胞株
人卵巢癌SKOV-3细胞、HO一8910细胞、HO一891OPM细胞均购自中科院上海细胞所(其中sKov-3细胞由ATCC引进),SKOV-3iP细胞来源于美国MD
Anderson肿瘤中心,由郁茵华教授惠赠。
SKOv-3细胞和SKOV-3ip细胞均为卵巢上皮浆液性囊腺癌细胞系,后者具有明显较高浸润转移能力(sKov-3ip细胞是由SKOV-3细胞经动物实验筛选从腹水中分离的高转移株);HO一8910细胞和HO一8910PM细胞均为卵巢上皮浆液性囊腺癌细胞系,后者是由前者建系而来,
具有明显较高浸润转移能力。
(二)主要试剂
1.RPMI一1640培养基(Gibeo公司)
2.胎牛血清(Gibeo公司)
3.磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2一7.4)(上海生工生物工程技术服务有限公司)
4.0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDI人)(Gibeo公司)
5.0.25%胰酶(不含EDTA)(Gibco公司)
6.肠1201(Invitrogen公司)
7.三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)
8.异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)
9.无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)
10.DEPC水(上海碧云天生物技术有限公司)
11·miscriptReverseTranseriptionKit试剂盒(QIAGEN公司)12.Real一timePCR试剂盒(Takara公司)
13.miRNAUniversalprimer试剂盒(QIAGEN公司)
14.miR一22引物粉末(上海生工生物工程技术服务有限公司)
15.二甲基亚飒(DMSO)(上海生工生物工程技术服务有限公司)
三、仪器及耗材
1.细胞培养箱(力新仪器上海有限公司)
2.超净台(上海上净净化设备有限公司)
3.细胞培养瓶、培养皿、6孔板、24孔板、96孔板、冻存管、离心管
(ComingCostar公司)
4.微量移液器(Eppendorf公司)
5.Eppendorf管、PCR薄壁管、8连排pCR板、96孔pCR板及板膜、移液器吸头(Axygen公司)
6.相差显微镜(Nikon公司)
7.电子天平(PC4400,Mettler公司)
8.摇床(ZD一9500,Kylin一Bell公司)
9.恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)
10.涡旋振荡器(VorteSGenieZ,SeientifieIndustrieS公司)n.磁力搅拌器(南汇电讯器材厂)
12.常温离心机(5424,Eppendorf公司)
13.超纯水制备仪(Milli一Q,Millipore公司)14.低温离心机(GS一15R,Beeklnan公司)
15.紫外分光光度仪(DU640,Beckman公司)
26.pCR仪(Eppendorf公司)
17.荧光定量pCR仪(ABI7500,AppliedBiosystems公司)18.酶标仪(iMark,Bio一Rad公司)
19.一80oC低温冰箱(UltraLow,SANYO公司)
20.一20℃低温冰箱(海尔公司)
21.液氮罐(乐山市东亚机电工贸有限公司)
二、方法
(一)细胞培养
1.人卵巢癌SKOV-3/SKOV-3ip细胞、HO一8910舰O一8910pM细胞在37℃、5%COZ、饱和湿度条件下,培养于含10%FBS的RPMI一1640培养基中。
2.细胞每3天左右以0.25%+0.02%EDI’A消化,1:
3一1:
4传代。
(二)Real一timeRT-peR检测miR一22表达水平
1.将2xlo5个细胞接种于含2.sml细胞培养基的6孔板中(即2xlo5个/well),培养48h后终止培养,弃培养基,以PBS洗涤细胞;
2.将细胞至于冰浴中,每孔加入lmlTrizol,反复吹打使细胞完全裂解;
3.裂解液移入无RNA酶的Eppendorf管中,室温静置smin;
4.加入0.2ml三氯甲烷,剧烈振荡305;4oC,12,000印mxlsmin;
5.小自将上层水相移至新的无RNA酶的Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,
颠倒混匀,室温静置10min;
6.4℃,12,000印mx1omin,弃上清;
7.加入lml75%乙醇(用DEPC水和无水乙醇按体积1:
3配制),悬浮沉淀;
8.4℃,7,500印mxs而n,弃上清;
9.重复步骤7、8
10.通风橱中干燥RNA沉淀,加30一50川DEPC水溶解沉淀;
11.紫外分光光度仪测定各样本RNA浓度,计算公式为:
RNA终浓度(林g乍l)=oD26ox稀释倍数x4o八000
12·根据miseriptReverseTranseriptionKit试剂盒说明,将l林g胭A逆转录为
cDNA,置一80℃或一20℃备用;13.检测miR-22表达引物序列:
miR-22特异引物:
5’一AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGI’A一3’
miRNA通用引物:
QIAGEN公司购买
14.U6引物序列:
U6For、vard:
5’一CTCGCTTCGGCAGCACA一3’
U6Reverse:
5’一AACGCTTCACGAAI,TTGCGT-3’
15.Real一timePCR检测miR-22表达水平:
按几kara试剂盒中匹配ABI7500仪器的使用说明,两步法扩增基因并实时定量检测荧光强度,溶解曲线分析引物扩增的特异性,步骤如下:
95℃6JJ内‘,里1,︸以On5I︺︵.1.555︸.5
95℃
x40循环
60℃
95℃
60℃
95℃155
16.以U6为内参,按2‘一△△Ct)法计算而R一22的相对差异。
(三)统计方法
采用SPSS13.O软件分析数据。
每个数据均代表三次独立实验的Mean士SD值。
叹
几组间均数差异t检验;P<0.05代表差异有统t!
一学怠义。
结果
Real一ti,neRT-pCR验证miR一22的表达差异:
在配对的SKOV-3/SKOV-3ip全旧胞户弓,.气侵袭力的SKOV-3ip细胞中miR一22表达水平明显低于SKov-3细胞(P 在配对的HO一8910/HO一89loPM细胞f司,,高俊袭力的 HO一8910PM细胞中miR一22的表达水‘}二明显低于HO一8910全{1}胞(P<0.01,图]一1)。 结果一与我们前期芯片结果一致。 李容解曲线显示,各组PCR扩增产物共有较好的特异性(图1一2和图1一3)。 .SKOV一3DSKOV一3iP圈HO一8910口HO一8910PM 勿澎比l一l比尸O门.Ud叱Ea 啊泪有友皿钾任彬生 l月l一1Real一tinleRT-pCR马成资证,niR一22在一niR一22在SKOV-3/sKOV一3ip全{11)J包、 HO一8910/HO一891OPM细J泡l、「: 」的表达差异 乙口匕少创J上J l曰曰曰川J门JJll︸|wl.|||eeewewewe||| 图l一ZRea! 一ti,nePCRi容角牟曲线显示nliR一22华因的扩增产物特异性较好 沙: ‘,I神、1以钾 。 一."﹄? 扮叮.冰一价小.1: 71 图1一3Real一timePCR溶解曲线显示U6基因的扩增产物特异性较好 第一部分结论 miR一22在高侵袭力的卵巢癌SKOv-3ip细胞不11HO一891OpM乡田)泡中呈相对低表达,一‘歹卵巢癌的浸润能力呈负相关: 第二部分: miR-22在细胞水平的功能研究 材料与方法 一、材料 (一)细胞株 同第一部分。 (二)主要试剂 1.Opti一MEM培养基(Gibeo公司) 2.Pre一miR‘I,入1miR一22Precursormoxecules,Pre一mi划AT入1miRNAprecursor moleeules一Negativeeontrol#l,Anti一miRTMmiR一22Inhibitors,Anti一miRTMmiRNA Inhibitors一Negativeeontrol#l(Ambion公司) 3.转染试剂51Po盯1汉‘NeoFxl,入‘TransfeetionAgent(Ambion公司)4.Mtrigel基J贡胶(BDBioscienees公司) 5.多聚甲醛粉末(卜海生仁生物工程技术服务有限公司) 6.苏木素染液(_1几海碧云天生物技术有限公司) 7.磺基罗月·l少J(SRB)(230162,Siglna公司) 8.冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司) 9.三氯乙酸(TCA)(上海生工生物工程技术服务有限公司)10.AnnexinV-pl凋亡检测试剂盒(Invitrogen公司) n.其余试剂同第一部分 (三)仪器与耗材 1.8拌m孔径聚碳酸脂膜24孔Transwell板(ComingCostar公司)2.正置荧光显微镜(BX51,Olympus公司) 3.流式细胞仪(FACSCulibur,BDBioseieneeS公司)4.其余仪器与耗材同第一部分 二、方法 (一)细胞培养 同第一部分。 (二)miRNAPrecursor/Inhibitor转染细胞 1.将细胞培养于25ml培养瓶中,待80%一90%融合度,转染备用; 2.将miRNApreeursor/InLhibitor粉末配成100拼m贮存液,取10件l贮存液稀释至 100拼l,即10协m稀释液备用; 3.以95仁l无血清Opti一MEM培养基稀释5林1siPO盯TMNeoFxTM转染试剂,轻轻混匀,室温静置10min; 4·miRNApreeursor转染: 以92.5林l无血清Opti一MEM培养基稀释7.5林l上述步骤1中的稀释液,与步骤2中稀释的转染试剂轻轻混匀,室温静置10min;m1RNAInhibitor转染: 以85闰无血清OPti一MEM培养基稀释15州上述步骤1中的稀释液,与步骤2中稀释的转染试剂轻轻混匀,室温静置10min,待转染复合体形成;5.用600川0.25%胰酶+0.02%EDTA消化细胞,用含10%FBS的即Ml一1640培养基终止消化,制成lxl护cen/ml的细胞悬液; 6.取上述细胞悬液20如l,以含10%FBS的好Ml一1640培养基稀释至2.3ml,与上述步骤4中配制的转染复合体混匀,接种于6孔板的一个孔中;此时,终体积为2.sml,细胞接种浓度为Zx1O5eell/well,miRNAPreeurso: 终浓度为3Onm,
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