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菠萝蛋白酶测定实验报告
菠萝蛋白酶提取、初步分离纯化及活性测定
14食安(5)班马俊宇30520516
摘要:
此次试验经过对菠萝皮中存在菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离;并采取考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质含量,利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后水解产物酪氨酸,在280nm处吸光值高低,判定酶活性大小。
从试验结果看出,纯化程度越高,提取液中蛋白质含量先降低,后升高。
同时,试验测得菠萝蛋白酶比活力、回收率随纯化程度提升而先升高后降低。
关键词:
菠萝蛋白酶纯化酶活性蛋白质含量
前言
菠萝蛋白酶关键分布于菠萝茎和果实中,能分解蛋白质、肽、脂和酰胺,含有较高生物活性,在各个生产领域中得到广泛应用[1]。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一个食品添加剂,能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来能够用来增加豆饼和豆粉PDI值和NSI值,从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油;澄清苹果汁;制造软糖;为病人提供可消化食品;给日常食品添味等。
在医药上它能够诊疗水肿及多个炎症,并有助消化,健胃消食等功效[2]。
菠萝萝蛋白酶pH在4.0~5.5处于较稳定状态,在中性环境中酶活保持最高,在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活[3]。
本试验研究粗提取、盐析和透析所得到菠萝蛋白酶提取液中蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等,对酶纯化情况进行研究。
1试验材料与仪器
1.1试验材料与试剂
新鲜菠萝(3个),盐析粗提液(PBS),酪蛋白试剂,激活剂,三氯乙酸(TCA),透析袋,牛血清蛋白,考马斯亮蓝,乙醇
1.2试验仪器
电子天平,台式天平,恒温水浴锅,冰箱,高速离心机,分光光度计,研钵,烧杯,量筒,容量瓶,移液管,漏斗,漏斗架,滤纸,试管,试管架,滴管,玻璃棒,纱布,洗耳球,标签纸,橡皮筋
DS-1型高速组织捣碎机:
上海标本模型厂
HZS-H型水浴振荡器:
哈尔滨市东联电子技术开发有限企业
2试验方法
2.1菠萝蛋白酶粗酶提取
称取菠萝皮材料20g,将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中,加入约60mL预冷0.1mo1/LpH7.8PBS,连续搅拌10~15min至粉碎,搅拌完成后用4层纱布过滤,得到滤液后,用冷冻离心机于4°C3000rpm离心6min,弃沉淀,即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液体积、蛋白质含量和酶活性。
2.2盐析
依据附录“硫酸铵饱和度计算表”,按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加固体硫酸铵量,称取固体硫酸铵于研钵中,研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵,边加边搅拌,使溶液最终硫酸铵饱和度为30%,放置于冰水混合物(4℃)30min后,酶蛋白沉淀析出,4°C4000rpm离心10min,搜集沉淀,加入0.1mo1/LpH7.8PBS约15mL至完全溶解,测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2.3透析
将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋(预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min)中,于500mL烧杯中,在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析,15min换水一次,换水3~4次后,检验SO42-是否已被除净(检验方法是:
取2mLBaCl2溶液放入一支试管,滴加2~3滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示SO42-未除净,若无沉淀出现,表示透析完全)。
若透析液有沉淀,将透析液用滤纸过滤,测定过滤液体积、蛋白质含量和酶活性。
2.4酶活力测定方法
取2支试管,设置一支为试验对照,三支为平行样品。
取0.1mL酶液,加入0.9mL激活剂,加入37℃预热1%酪蛋白溶液1mL,正确反应10min,加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液,后加酪蛋白溶液,其它与测定管相同。
离心(3000r/min,5min)或过滤,清液于280nm波长下测定光吸收值。
酶活单位定义:
在上述条件下,每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位(U)。
试验步骤根据表格1中完成。
试剂(ml)
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
TCA
3
—
—
—
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
激活剂
0.9
0.9
0.9
0.9
酪蛋白
1
1
1
1
37°C正确反应10min
TCA
—
3
3
3
A280nmOD值
表格1
3试验结果与分析
依据上述试验步骤,测得粗提取、盐析、透析得到酶制剂在280nm处吸光值以下表2示
A280nm
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
粗提取
0
0.523
0.501
0.433
盐析
0
0.534
0.449
0.469
透析
0
0.493
0.450
0.535
表2
3.1蛋白质含量计算
1
2
3
3.1
3.1.1标准曲线绘制
0-1000ug/ml标准曲线绘制如表3
管号
1
2
3
456
1000μg/mL牛血清白蛋白(mL)
蒸馏水(mL)
蛋白质浓度(μg/mL)
0
1.0
0
0.2
0.8
200
0.4
0.6
400
0.60.81.0
0.40.20
6008001000
表3
另取6支试管编号,按表中加入试剂。
得到从1到6号管牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL,正确吸收各管溶液0.lmL,加入5ml考马斯亮蓝溶液,摇匀,静置2min,测定595nm吸光值,绘制0-1000μg/mL标准曲线。
测得不一样蛋白质浓度在595nm处吸光度以下表4所表示
蛋白质浓度μg/ml
0
200
400
600
800
1000
A595nm
0
0.120
0.339
0.476
0.599
0.720
表4
绘制蛋白质标准曲线以下图1示
3.1.2样品测定
正确吸收样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中,与步骤
(1)操作相同,测得样品光吸收值A595nm。
测得样品吸光值以下表5示。
样品
粗提取蛋白质
盐析蛋白质
透析蛋白质
吸光度
1.036
1.223
1.263
1.042
1.189
1.309
1.027
1.216
1.274
平均值
1.035
1.209
1.282
表5
3.1.3结果计算
由标准曲线可查出对应蛋白浓度(μg/mL),可按以下公式计算出样品中蛋白含量。
查出蛋白提取液浓度(μg/mL)×定容体积(mL)
样品蛋白含量(μg/g鲜重)=─────────────────—————
样品重量(g)
试验所用样品质量为20g,依据标准曲线计算样品中蛋白质含量以下表6示
粗提取
盐析
透析
定容体积/ml
59
15.5
17.8
蛋白质提取液浓度μg/ml
1469.9
1718.4
1822.7
样品蛋白质含量μg/g鲜重
4381.59
1344.11
1635.95
样品总蛋白质含量mg
86.72
26.64
32.44
表6
3.2酶活力计算
酶液活力(U/mL)=×稀释倍数
样品酶活力计算以下表7示
粗提取
盐析
透析
A280nm平均值
0.606
1.025
0.738
蛋白质提取液酶活力U/mL
6060
10250
7380
总活力U
357540
158875
131364
表7
3.3酶比活计算
酶比活(U/mg·蛋白)=酶活力/酶蛋白质含量
酶比活计算结果以下表8示
粗提取
盐析
透析
酶比活U/mg·蛋白
4122.9
5963.8
4049.4
表8
3.4酶纯化过程中回收率计算
回收率(%)=(纯化酶总活力/粗酶液总活力)×100
=〔(纯化酶活力×纯化酶液体积)/(粗酶活力×粗酶体积)〕×100
3.5酶纯化倍数计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
3.6试验结果
将测定数据整理计算分别填入下表9示,并将菠萝蛋白酶分离纯化效果进行分析和讨论。
菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤
总体积(mL)
总蛋白质含量(mg)
总活力(U)
比活力(U/mg·蛋白)
回收率(%)
纯化倍数
粗提取
59
86.72
357540
4122.9
100
1.00
盐析
15.5
26.64
158875
5963.8
44.4
1.45
透析
17.8
32.44
131364
4049.4
36.7
0.98
表9
依据表9得出以下结论,在粗提取、盐析和透析得到提取液中:
①蛋白质含量先下降,后上升;②蛋白酶总活力逐步下降;③蛋白质提取液比活力先上升,后下降;④酶纯化过程回收率分别为100%、44.4%和36.7%;⑥纯化倍数分别为1.00、1.45和0.98。
4试验结论与讨论
4.1数据分析
a)本试验中利用粗提取→盐析→透析方法分离提纯菠萝皮中所含菠萝蛋白酶。
菠萝蛋白酶盐析后蛋白质提取液浓度最高,粗提取次之,透析最低。
伴随盐析和透析进行,菠萝蛋白酶蛋白质含量和酶活力依次降低。
菠萝蛋白酶盐析后酶比活最高,粗提取略次之,透析最低。
b)提取液中总蛋白含量下降,这是因为对菠萝皮提取液进行了纯化和分离,提取液中除了菠萝蛋白酶外其她物质被除去,酶蛋白纯度提升。
但提取液中总蛋白含量下降。
c)透析后比活力下降,理论上比活力应该升高,下降原因可能是,试验采取是优异行粗提取,再进行盐析,后进行透析,伴随反应时间延长酶逐步失活,造成最终测得酶比活力下降。
也可能是试验环境中温度、pH、金属离子等原因影响了酶分子活性。
d)酶回收率随酶纯化程度增强而降低。
酶回收率表示酶稳定性。
从试验结果看出,酶回收率下降,可能原因是反应时间延长、环境温度、pH、金属离子等原因影响了酶稳定性,使酶回收率下降。
菠萝蛋白酶因含有一个不稳定游离巯基,所以在试验过程中极易被氧化而使其酶活下降[4]。
e)盐析纯化倍数大于1,透析纯化倍数小于1。
盐析因为反应时间较短,纯化效果很好,纯化倍数是大于1。
而因为ii、iii中提到原因对菠萝蛋白酶活性影响,造成纯化后酶对比于粗提取酶,活性更低。
所以透析得到纯化倍数为小数。
4.2预防酶失活变性方法
因为菠萝蛋白酶是一个巯基蛋白酶,极易被氧化而使其酶活下降。
通常能使蛋白质变性原因都可能使它失去活性,比如物理原因温度、时间、压力、光、磁场;化学原因氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、pH和生物原因酶修饰和酶降解[5]。
所以分离纯化时候要注意不能用不洁净仪器(盛装过PBS)来盛装酶液,不能靠近万用炉,不能用自来水作为透析液。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,能够利用乙二胺四乙酸,它是一个螯合物,可有效地螯合原料中一些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则含有还原性,分子上活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA和L-半胱氨酸组合,效果最好[5]。
维生素C,也能够增强菠萝蛋白酶稳定性,使菠萝蛋白酶活性也有所提升,使用维生素C也比较经济[6]。
4.3常见酶活性表示方法
a)U/mL酶液:
1mL液体酶,1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个酶活力单位。
用于表示液体酶中酶活大小;
b)U/mg蛋白质:
1g酶制剂,1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个活力单位。
用于表示酶制剂中酶活大小;
c)U/g干重或鲜重:
1g样品,1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个活力单位。
表示材料中酶活大小。
4.3硫酸铵盐析选择0%~30%饱和度原因
试验中硫酸铵盐析选择30%饱和度,是因为伴随硫酸铵浓度逐步增大,盐析得到菠萝蛋白酶酶活回收率逐步增大,当硫酸铵饱和度达成40%时侯菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%,往后开始逐步减小,当硫酸铵饱和度越大时,菠萝皮浸提液盐析效果越好[6],所以取30%左右最好。
参考文件
[1]欧英杰.萝蛋白酶酶活力影响原因及测定酶活力方法研究进展[J].广东化工.(37):
40-51
[2]章佩芬,郭勇,罗焕敏等.菠萝蛋白酶研究与应用进展[J].华西药学杂志,,17
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128-129.
[3]董瑞兰.菠萝蛋白酶分离纯化及部分应用性质研究.[D].福建:
福建农林大学,
[4]朱明英,林文光.菠萝蛋白酶提取和分离[J].云南热作科技,1998,21
(1):
22-23.
[5]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平.菠萝果浸提取液中菠萝蛋白酶稳定性研究[N].广西名族大学学报,(14):
76-78
[5]郑昆,隋新,张晓杰,唐艳梅,白鹭.菠萝蛋白酶提取初步研究[J].吉林化工学院学报,,22
(1):
16-18.
[6]梁宏宇.菠萝蛋白酶提取方法研究[D].南宁:
广西民族大学,.
[7]田亚平,周楠迪.生化分离原理与技术[M].北京:
化学工业出版社,.
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