抗体纯化大全.docx
- 文档编号:11881920
- 上传时间:2023-06-03
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:29.78KB
抗体纯化大全.docx
《抗体纯化大全.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗体纯化大全.docx(11页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
抗体纯化大全
之老阳三干创作
抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基来源根基理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的经常使用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质概况的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度分歧,因而可利用分歧浓度的盐溶液来沉淀分歧的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通经常使用饱和度来暗示。
硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不容易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器·组织培养上清液、血清样品或腹水等·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS)·蒸馏水·PBS(含0.2g/L叠氮钠)(见附录一)·透析袋·超速离心机·pH计·磁力搅拌器 实验步调 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种分歧的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通经常使用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS)将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到pH7.0。
此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1mol/L,25°C);其它分歧饱和度硫酸铵溶液的配制见表1; 二、沉淀1、样品(如腹水)20000´g离心30min,除去细胞碎片;2、保存上清液并丈量体积;3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:
1(v/v);4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。
三、透析1、蛋白质溶液10000´g离心30min(4°C)。
弃上清保存沉淀;2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6小时换透析缓冲液一次,以完全除去硫酸氨;3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。
应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。
1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:
1(v/v);2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C);3、3000´g离心30min(4°C),保存上清液;4、上清液再加SAS到0.5:
1(v/v),再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨;5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度不同很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的;二、为防止体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1);三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。
参考文献 1、Burd,R.S.,Raymond,C.S.,Ratz,C.AandDunn,D.L(1993)ArapidprocedureforpurifyingIgMmonoclonalantibodiesfrommurineascitesusingaDEAE–disk.Hybridoma12,135.2、T.G.库珀着,徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版(1980),353。
(夏泉)表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度(S1)提高到终浓度(S2)时需加硫酸氨的量(g/L)0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%5611414417619620924327731335139043047251656166276757861181371501832162512883263654064494945926492959789112315518922526230034038242452061930496193125158193230267307348390485583193062941271621982352733143564495461243741071421772142522923334265223163941291642002382783194115063163971321682052452853754693265991341712102503394313366101137176214302392336710314117926435334691051432273143470107190275 3572153237361151987715779 第二节DEAE离子交换层析法 基来源根基理 离子交换层析是蛋白质纯化的惯例方法,与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。
DEAE是一种阴离子交换剂,当蛋白质溶液通过DEAE柱时,带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸 附,带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。
纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电 点的缓冲液,此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上,然后用增加盐浓度 的方法将抗体洗脱。
可以用连续梯度法洗脱,也可以用不连续梯度(分段洗脱)法洗脱。
本文以腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。
试剂及仪器 ·抗体样品(小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体)·DEAE离子交换剂(阴离子交换剂)·Æ´20cm)·缓冲液A:
25mmol/LTris-HClpH8.8+35mmol/LNaCl·缓冲液B:
25mmol/LTris-HClpH8.8+70mmol/LNaCl·缓冲液C:
25mmol/LTris-HClpH8.8+500mmol/LNaCl · ·PBS(见附录一)·透析袋(MWCO10000)·磁力搅拌器·蠕动泵和部分收集器·紫外检测仪·梯度发生器·电导仪·pH计·离心机 实验步调 整个层析过程最好在4°C进行,可在冷室操纵; 1、抗体样品对缓冲液B透析过夜(4°C);2、按说明处理DEAE离子交换剂。
然后用缓冲液A平衡。
用20倍体积缓冲液A洗交换剂,可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A;3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A中,装入层析柱。
4、用等体积的缓冲液D稀释透析过的抗体样品,使之与缓冲液A的离子强度一致;5、稀释后的样品10000´g离心10min(4°C),除去沉淀变性的蛋白质;6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接;7、抗体样品以1ml/min流速上柱,然后用缓冲液A洗柱1ml/min,将未吸附的蛋白质洗出。
直到流出液在280nm的吸光度小于0.05;8、吸附的蛋白质,用连续增加NaCl的浓度来洗脱。
用线性梯度缓冲液(35-500mmol/LNaCl)或分段缓冲液(35、70、140、280、500mmol/LNaCl)洗脱。
流速1ml/min,分部收集洗脱液2ml/管(图2-4-1);9、椐紫外检测结果,将抗体峰部分合并。
装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4°C透析或冷冻(视抗体的稳定性而定);10、DEAE离子交换剂可依照商品说明再生使用。
图2-4-1DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG 检测方法 1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50—200mmol/LNaCl浓度之间洗脱。
2、可用SDS-PAGE或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。
实验要点及说明1、要得到满意的分离结果,每mlDEAE离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超出10mg。
2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品,可得到更好的纯化结果。
3、如抗体与DEAE离子交换剂不克不及有效的结合,可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。
4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器,可用手工上样和收集。
洗脱液每管收集0.5-2ml,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。
5、该方法可按比例扩大。
用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。
参考文献1.Corthier,G.,Boschetti,E.andCharley-Poulain,J.(1984)ImprovedmethodforIgGpurificationfromvariousanimalspeciesbyionexchangechromatographyJ.Immunol.Meth.66,75-79. 2、张保真编译西安医科大学出版(1986)《免疫组织化学理论与技术》69-71。
(夏泉)第三节羟磷灰石层析纯化抗体 基来源根基理 羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]吸附蛋白质的机理,通常认为与其晶体概况的Ca2+和PO43-两种基团相关。
因为带电基团紧密排列于晶体概况,可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。
样品被吸附剂吸附后,用适当的洗脱液(较高浓度的盐溶液)冲洗,可使之解析。
解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动,遇到前面新的吸附剂可再被吸附。
在反复的吸附—解析—再吸附—再解析的过程中,由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能力分歧,它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同,所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度分歧而被分离。
抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。
试剂及仪器 ·抗体样品(腹水或培养上清液)·羟磷灰石(Hydroxylapatite有售)·Æ´20cm)·吸附缓冲液:
20mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.8含30mmol/LNaCl·洗脱缓冲液:
500mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.8含30mmol/LNaCl ·PBS(见附录1)·透析袋(MWCO10000)·磁力搅拌器·蠕动泵和部分收集器·紫外检测仪·梯度发生器·离心机 实验步调 1、羟磷灰石柱的准备:
将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中,使之充分水合后装柱。
用10´柱体积的吸附缓冲液洗柱;2、样品的预处理:
含抗体的样品先在4°C对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液10倍稀释,再将透析或稀释后的样品4000´g离心15min(4°C);3、仪器装置:
将蠕动泵、紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接;4、上样:
将样品上清液以1ml/min的流速加到柱上,然后用20´柱体积的吸附缓冲液洗柱;5、抗体的洗脱:
提高磷酸盐的浓度可以将抗体洗脱。
经常使用的方法有两种:
一种是用梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱,浓度为20—500mmol/L的磷酸钾缓冲液;另一种方法是用不连续浓度梯度洗脱,例如可以用35、70、140、280和500mmol/L的磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。
收集洗脱液2ml/管(图2-4-2);6、合并洗脱液中含抗体的部分(见下面检测)对PBS透析。
根据抗体的稳定性4°C或冷冻防腐(0.2g/L叠氮钠)保管; 图2-4-2羟磷灰石柱层析纯化单克隆抗体IgG流速:
1ml/min样品:
腹水1ml 检测方法 1、单克隆抗体IgG通常在200—400mmol/L磷酸钾浓度之间洗脱。
2、可用SDS-PAGE或定量免疫学方法(RIA、ELISA),检测各部分洗脱液的抗体。
应用提示 1、每100ml羟磷灰石可吸附大约500ml细胞培养上清液或3ml的腹水或血清中所含的抗体。
2、使用羟磷灰石柱较适合的柱长/直径可以在5/1—15/1之间(典型尺寸:
2.5cmÆ´20cm柱长)。
3、在吸附过程中应防止有对钙的亲和力大于磷酸盐的物质(如EDTA和柠檬酸等)的存在,以免减少羟磷灰石的吸附容量。
4、用过的羟磷灰石柱可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。
或加入甲苯(0.03%,v/v)或叠氮钠(0.2g/L)储存。
5、如果没有合适的蠕动泵和部分收集器,可手工加样和收集洗脱液2ml/管,并用分光光度计测定各管在280nm波长的吸光度。
6、与本方法类似的吸附和洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。
参考文献 Bukovsky,J.andKennett,R.H.(1987)Simpleandrapidpurificationofmonoclonalantibodiesfromcellculturesupernatantandascitesfluidsbyhydroxylapatitechromatographyonanalyticalandpreparativescales.Hybridoma6,219-228.(夏泉) 第四节抗体的辛酸纯化法 基来源根基理 在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸,可与其中大部分蛋白质形成沉淀,而对IgG的性质没有影响,因此是纯化IgG的有效途径。
沉淀后经离心即可获得IgG。
辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成,但与其相同,所得的抗体纯度不敷,还需用其它方法以进一步提高其纯度。
试剂及仪器 s腹水或细胞培养上清s0.06mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)(见附录1)s1NHCls辛酸(正-八碳酸,n-octanoicacid)s1NNaOHsPBS(见附录)s透析袋(MWCO10,000)s电磁搅拌器s离心机 操纵步调 1.用烧杯加20ml0.06mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)到10ml腹水或细胞培养上清中;2.用1NHCl调节pH到4.8,后滴加辛酸同时用力搅拌,具体用量拜见表1;3.在室温下继续搅拌30分;4.5,000×g室温离心30分,保存上清;5.用1NNaOH调节pH到5.7;6.含有IgG的上清对PBS透析,然后分装、置-20℃保管。
表1沉淀分歧来源IgG的辛酸参考用量 IgG来源辛酸用量(每10ml腹水或上清)小鼠400μl人700μl羊700μl兔750μl质量检察 上清中IgG的纯度可用SDS-PAGE分析及合适的酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定。
上清中可能存在少量杂质,可通过DEAE离子交换层析除去。
参考文献 1.Russo,C.,Callegaro,L.,Lanza,E.,andFerrone,S.(1983)PurificationofIgGmonoclonalantibodybycaprylicacidprecipitation.J.Immunol.Meth.65,269-2712.Steianbuch,M.andAudran,R.(1969)TheisolationofIgGfrommammalianserawiththeaidofcaprylicacid.Arch.Biochem.Biophys.134,279-284 (朱正美)第五节Sephadex凝胶过滤纯化抗体 基来源根基理 凝胶过滤又称分子筛层析。
是一种借助分子筛效应将分子大小分歧的混合物进行分离的方法。
交联葡聚糖凝胶Sephadex是经常使用的层析介质。
它是一种含有许多网眼的球形小颗粒,网眼大小分布均一。
当分子大小分歧的混合物通过凝胶柱时,其中较大的分子不克不及进入凝胶网眼,将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出,而小分子物则能扩散进入网眼,被阻滞在层析柱上,分子量越小,扩散出来所耗时间就越长。
因此分子大小分歧的MoAb可以借助分子筛效应进行分离提纯。
本文以IgM的纯化为例介绍此方法。
IgM因分子特别大(900kd)而不克不及进入凝胶颗粒的网孔,可首先被洗脱达到初步纯化的目的。
试剂和器材 ·SephadexG100或G200 ·粗制IgM-MoAb培养物或抗血清,腹水等· ·层析柱(1.0cmÆ´Æ´40cm)·透析袋(MWCO10000)·磁力搅拌器·部分收集器·紫外检测仪·离心机 步调 1、样品处理:
将腹水、抗血清或培养上清液离心4000´g20分钟,以除去细胞碎片。
较稠的腹水和血清需适当稀释;2、装柱:
根据样品量选择合适的层析柱,将0.01mol/LpH8.0含0.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液加到柱长的1/4处,然后将漂洗溶涨的SephadexG100或G200倾入柱中,自然沉降30分钟,再用同样的缓冲液平衡柱1小时,流速0.5ml/min;3、仪器连接:
将紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接;4、上样和洗脱:
待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上概况时,缓慢加入样品溶液0.5ml/min。
当样品液面接近凝胶上概况时,加少量缓冲液清洗柱壁,然后接上缓冲液洗脱并收集1-2ml/管。
280nm检测的第一蛋白峰即为IgM-MoAb。
5、浓缩与保管:
将280nm检测的第一蛋白峰合并,移入透析袋在磁力搅拌器上4°C对PBS流动透析过夜。
透析后的溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后,分装封管,-20°C保管备用。
检测 1、可用SDS-PAGE或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液的抗体。
2、IgM-MoAb一般在外水体积洗脱。
应用提示 1、凝胶过滤不变换洗脱液,一次装柱后可反复使用多次。
操纵简单,快速经济。
2、实验可重复性高,样品回收几乎可达100%,且方法温和,不容易引起生物样品变性失活,可进行大量样品的分离纯化。
3、用于小分子物(如无机盐)从大分子物(MW>20000)分离的层析柱,柱体积应大于样品体积4-10倍,其高与直径的比例应为5:
1-15:
1;用于大分子物之间的分离(如免疫球蛋白之间的分离),则柱体积应大于样品体积25-100倍,高与直径的比例应为20:
1-100:
1。
4、Sephadex凝胶装柱时,应灌制均匀无断层和气泡。
在整个操纵过程中,凝胶应始终坚持在液面以下。
5、提取的IgM浓度过低或反复冻融会引起变性,应分装后在-70°C或-20°°C可保管数月。
6、如无合用的部分收集器,可手工收集1-2ml/管,用分光光度计测定各管吸光度值。
参考文献 1、周本正编着《层析技术及其应用》湖北科学技术出版社(1992)28-302、M.Z.阿塔西,C.J.范奥斯,D.R.阿勃索洛姆主编郑昌学,吴安然等译《分子免疫学》科学出版社(1988)212-214 第六节免疫球蛋白G的亲和层析纯化法(蛋白A或蛋白G法) 基来源根基理 蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁(cellwall)(cellwall)成分。
蛋白G是G组链球菌的细胞壁(cellwall)(cellwall)成分。
这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白的FC区和大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG结合(见表1)。
利用基因工程(GeneticEngineering)(GeneticEngineering)技术,将蛋白A和蛋白G分子中与Fc区结合的结构域部分的基因融合,所发生的融合蛋白,则具有更广泛的IgG结合特异性。
蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G与免疫球蛋白Fc段的结合性能使它成为可用于IgG分离的、天然的亲和配基。
将这些配基蛋白结合到固体支持物上,提供了应用亲和层析纯化抗体的一步法的基础。
试剂及仪器 l含IgG的样品lPBS(见附录)l装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应)l透析袋(MWCO10,000)l结合缓冲液:
0.1mol/LTris-HClpH7.5+0.15mol/LNaCll分步收集器(可按需要选用)l洗脱缓冲液:
0.1mol/LGly-HClpH2.8+0.15mol/LNaCll中和缓冲液:
1mol/LTris-HClpH8.0l蠕动泵(可按需要选用)lUV监测器lpH计 操纵步调 *样品(可为血清、腹水、含有IgG的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液)。
1.样品在4℃,对结合缓冲液透析过夜,或将其与至少1:
1稀释的结合缓冲液混合;2.如果条件充许,将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连;3.至少用10ml结合缓冲液,以1ml/min速度,洗涤柱中的2ml亲和层析介质;4.上样;5.一旦样品进入凝胶,用结合缓冲液洗柱(至少10个柱体积),直至A280nm小于0.03;6.用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,分布收集2ml/管;7.收集过程中,每管立即加入0.1ml中和缓冲液,以中和洗脱所得的IgG液。
8.含IgG的各管对PBS透析,其后根据抗体的稳定性,加入防腐剂(0.020g/L叠氮钠),置4℃或冷冻保管。
实验要点及说明 通常可通过SDS-PAGE分析或通过适当的免疫方法(如Westernblot,ELISA等),对洗脱组分进行纯度鉴定和免疫活性测定。
1.上样量由层析柱的对特定免疫球蛋白的容量确定,2ml柱对于小鼠IgG的容量约10mg,对于人IgG的容量约为18mg;2.柱上结合的抗体被洗脱的速度很快,通常在第一洗脱流份中;3.下列缓冲液也可用为结合缓冲液:
含0.15mol/LNaCl的50mmol/L硼酸钠pH8.0,或含0.15mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐液pH7.5。
高盐结合缓冲液(>1mol/LNaCl)可能增加总的柱结合容量约50%;4.应用pH8.0-9.5的缓冲液作为结合缓冲液,通常能增加蛋白A对小鼠IgG的结合力;5.对于蛋白G的层析柱,可用低pH的结合缓冲液,如pH5.0含0.15mol/LNaCl的50mmol/L醋酸缓冲液;6.对pH敏感的抗体,需用比较温和的洗脱液,如:
含0.2mol/LNaCl的0.1mol/LTris-醋酸pH7.7或3mol/LKCl或5.0mol/LKI或3.5mol/LMgCl2;7.蛋白G也能与IgG的CH1区结合,所以不克不及用于F(ab’)2与Fc的分离;8.如果无蠕动泵和部分收集器可用,也可利用重力进行上样及洗脱,手动收集2ml/管,用分光光度计测定280nm的吸光度。
参考文献 1.Bjorck,L,AndKronvall,G.(1984)PurificationandsomepropertiesofstreptococcalproteinG,anovelIgGbindingreagent.J.Immunol.133,969-9742.Eliasson,M.,Olsson,A.,Palmcramtz,E.,Wiberg,k.,Inganas,M.,Guss,B.,Lindberg,M.,andUlldh,M.(1988)ChimericIgG-bindingreceptorengineeredfromstaphylococcalprotinAandstreptococcalproteinG.J.Biol.Chem.263,4323-4327.(张文利、朱正美)第七节应用酶解从IgG制备F(ab’)2的方法 基来源根基理 本文介绍应用胃蛋白酶及菠萝蛋白酶从IgG制备F(ab’)2的方法。
这两种酶均在免疫球蛋白的绞链区双硫键的下方分解IgG(见图1),裂解产品为三个片段,即两个相同的Fab段和一个Fc段,Fab段即抗原结合片段,含有一条完整的轻链和半条重链,分子量约50000。
首选的酶是胃蛋白酶,它在IgG的绞链区二硫键的近C末端切断重链,生成大、小两个片段,大片段为Fab双体,称为F(ab’)2,其功能与Fab相同。
胃蛋白酶可用于大多数的小鼠的IgG1及IgG2a
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 抗体 纯化 大全