整理第78周《发酵工程与设备》讲义第二章.docx
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整理第78周《发酵工程与设备》讲义第二章
《发酵工程与设备》教案首页
教授时间2013-2014-01学期教案编写时间2013年8月
课程名称
发酵工程与设备
课程代码
总学时:
80学时
讲课:
48学时
实验:
32学时
实习:
周
学分
3.5
课程性质
必修课(√)选修课()
理论课(√)实验课(√)
任课教师
黄芳一
职称
副教授
授课对象
11级生物工程、生物技术专业
教材和
主要参考
资料
教材:
陶兴无.发酵工艺与设备.北京:
化学工业出版社,2011.
主要参考资料:
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化学工业出版社,2006.
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化学工业出版社,2004.
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科学出版社,1999.
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化学工业出版社,2000.
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中国农业出版社,1996.
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中国轻工业出版社,2004.
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化学工业出版社,2008.
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科学出版社,2007.
[11]姚汝华.微生物工程工艺原理.广州:
华南理工大学出版社,1996.
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化学工业出版社,2003.
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华南理工大学出版社,2000.
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中国轻工业出版社,1997.
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中国轻工业出版社,1992.
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高等教育出版社,2006.
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华东理工大学出版社,2006.
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参考国家级精品课程网站:
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[4]
[5]
[6]
[7]
[8]http:
//e-
[9]
教学目的
和
教学要求
学生在学过生物化学、微生物学、工程制图、物理化学和化工原理等课程的基础上,通过本课程的学习,了解和掌握运用微生物发酵生产工艺过程的基本原理和方法,理解发酵过程的规律及不同发酵操作方式的特点和应用,理解不同类型的生物反应器工作原理,懂得如何应用这些基本理论去分析和解决生产过程中的具体问题,改造原有生产过程使其更符合客观规律,实现发酵过程的优化,提高生产效率,创造更大的经济效益和社会效益。
教学重点
和难点
重点:
以生物化学和微生物学及工程学为基础,熟悉发酵工业一般工艺过程及原理,理解发酵过程中微生物及生物化学变化过程,掌握发酵产品工艺控制的关键点。
难点:
发酵过程中菌种代谢调控原理及技术应用;
发酵过程中微生物及生物化学变化过程。
教学进程
课次
教授章节
学时
备注
1
第一章绪论
第一节 发酵技术的起源(1学时)
第二节 发酵工程内容及特点(1学时)
2
2
第一章绪论
第三节 发酵工程的应用领域(1学时)
第四节 发酵技术的发展趋势(1学时)
2
3
第二章菌种的选育及培养基设计
第一节 微生物的代谢及调控(1学时)
第二节 微生物代谢控制育种的措施(1学时)
2
讲授+图片
4
第三节 生产菌种的选育方法(2学时)
2
讲授+图片
5
第四节 菌种的扩大培养及保藏(2学时)
2
举例
6
第五节 发酵培养基的设计(2学时)
2
举例
7
第三章灭菌与除菌工艺及设备
第一节 发酵有害微生物控制(2学时)
2
举例
8
第二节 培养基灭菌(2学时)-1
2
讲授+图片
9
第二节 培养基灭菌(1学时)-2
第三节 无菌空气制备(1学时)-1
2
讲授+实例
10
第三节 无菌空气制备(1学时)-2
第四节 设备管道的清洗与灭菌(1学时)
2
举例
11
第四章 厌氧发酵工艺及设备
第一节 厌氧发酵机制(2学时)
2
讲授+图片
12
第二节 白酒与酒精发酵(2学时)-1
2
讲授+实例+图片
13
第二节 白酒与酒精发酵(2学时)-2
2
14
第三节 啤酒发酵(2学时)-1
2
讲授+实例+图片
15
第三节 啤酒发酵(2学时)-2
2
讲授+实例+图片
16
第五章 好氧发酵工艺及设备
第一节 好氧发酵机制(2学时)-1
2
讲授+实例+图片
17
第一节 好氧发酵机制(2学时)-2
2
讲授+实例+图片
18
第二节 发酵过程的工艺控制(2学时)-1
2
讲授+实例+图片
19
第二节 发酵过程的工艺控制(2学时)-2
2
20
第三节 通风发酵设备(2学时)-1
2
21
第三节 通风发酵设备(2学时)-2
2
讲授+图片
22
第四节 发酵染菌及防治(2学时)
2
讲授+实例
23
第六章 发酵动力学
第一节 发酵过程定量描述(1学时)
第二节 分批发酵(1学时)-1
2
讲授+图片
24
第二节 分批发酵(1学时)-2
第三节 连续发酵(0.5学时)
第四节 补料分批发酵(0.5学时)
2
工厂视频
章节
第二章生产菌种的选育培养及发酵培养基设计(8学时)
教学目的和要求
了解微生物的代谢及调控机理,理解代谢调控在菌种选育中的重要性;
了解菌种改良的原理和途径,熟悉新菌种的分离和筛选过程;
掌握菌种扩大培养的工艺流程和菌种的保存方法;
理解发酵培养基的设计思路和优化原则,掌握发酵培养基的设计。
教学重点与难点
重点:
新菌种的分离和筛选过程;菌种扩大培养的工艺流程和菌种的保存方法
难点:
微生物的代谢及调控;发酵培养基的设计与优化
教学进程(含章节教学内容、学时分配、教学方法、帮助手段)
菌种设备性能
决定发酵的三要素发酵营养条件
提取工艺工艺条件
环境条件
第一节 微生物的代谢及调控(1学时)
一、微生物的初级代谢与次级代谢
(一)初级代谢和初级代谢产物
1.定义
(1)初级代谢(primarymetabolism)
书中:
具有明确的生理功能,对维持生命活动不可缺少的物质代谢过程。
微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质的代谢体系。
百科:
一般将微生物从外界吸收各种营养物质,通过分解代谢和合成代谢生成维持生命活动的物质和能量的过程,称为初级代谢。
(2)初级代谢产物(菌体对数生长期产生)
初级代谢产物:
微生物在代谢中,产生具有明确的生理功能,对维持生命活动不可缺少的物质称为初级代谢产物。
如:
氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸和维生素等。
(二)次级代谢和次级代谢产物
1.定义
(1)次级代谢(secondarymetabolism)
书中/百科:
微生物在一定的生长时期,以初级代谢产物为前体,合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。
(2)次级代谢产物(一般是对数期后期或稳定期)
百科:
微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能,或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质,称为次级代谢产物。
如维生素、抗生素、色素、生物碱、生长激素和毒素等。
初级代谢与次级代谢产物比较(让学生完成表格中内容)
代谢类型
代谢特点
产物产生时期
产物类型
初级代谢
明确生理功能,不可缺
对数期
氨基酸、核苷酸、糖类、脂肪酸等
次级代谢
无明确功能,非必需
对数期后期
或稳定期
维生素、抗生素、色素、生物碱、生长激素和毒素等
二、微生物代谢的调节及控制
(一)微生物代谢的自我调节机制
1.酶合成(酶量)的调节——诱导与阻遏
诱导(induction):
凡是能促进酶合成的现象。
诱导酶依赖诱导物的存在。
阻遏(repression):
指酶生物合成被阻止的现象。
(1)末端代谢产物反馈阻遏:
由于终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成阻遏的现象。
常常发生在氨基酸,嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成中。
(2)分解代谢产物阻遏:
当细胞内同时存在两种可利用底物(C或N)时,利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。
葡萄糖效应:
大肠杆菌利用混合碳源生长时,发现葡萄糖会抑制其它糖的利用。
二次生长现象:
大肠杆菌在含乳糖和葡萄糖的培养基中,优先利用葡萄糖,并只有当葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖,这就形成了在两个对数期中间的第二生长停滞期。
2.酶活性的调节——激活与抑制
激活(enzymeactivator):
在分解代谢途径中,催化后面反应的酶的活性可被前面反应的中间产物所促进。
抑制(enzymeinhibitor):
某一代谢途径的末端终产物过量产生后,它会直接作用于该途径中第一个酶,使其活性受到抑制,从而促使整条途径的反应速度减慢或停止,避免末端产物的过多积累。
反馈抑制的优点:
作用直接、效果快速,当末端终产物降低时又可重新解除。
变构调节——变构酶(allostericenzyme)
酶活性调节
修饰调节——共价调节酶(covalentregulatoryenzyme)
(二)微生物代谢的人工调控——代谢控制发酵
代谢控制发酵(metaboliccontrolfermentation):
是指利用生物化学和遗传学的原理,利用生物工程手段控制微生物的代谢朝人们希望的方向进行,更多地产生和积累人们需要的目的产物。
控制育种(内因):
通过遗传变异改变正常代谢途径和方向。
控制方法
控制发酵条件(外因):
供氧、营养类型和浓度、pH、表面活性剂等。
第二节 微生物代谢控制育种的措施(1学时)
一、营养缺陷型突变株
营养缺陷型(auxotrophicmutant):
野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养(氨基酸,维生素,核酸等)的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长,称为营养缺陷型。
筛选缺陷型菌株:
诱发突变→淘汰野生型菌株→检出缺陷型→鉴别缺陷种类。
(一)解除反馈调节的营养缺陷型突变菌株
精氨酸缺陷型突变株:
谷氨酸棒杆菌→鸟氨酸(氨基酸甲酰转移酶缺陷)
(二)控制细胞膜通透性的营养缺陷型突变菌株
生物素缺陷型(biotinauxotroph):
使细胞中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成受阻,影响磷脂合成,达到细胞膜缺损。
渗漏性缺陷型(leakymutant):
特殊的营养缺陷型,其缺陷的酶活性下降而非完全丧失。
二、代谢终产物的结构类似物抗性突变株
机制:
结构类似物由于在分子结构上与分解代谢的末端产物相似,能与阻遏蛋白相结合,如调节基因发生突变而使阻遏蛋白不能与结构类似物结合,即出现抗性菌株,也不能与正常的分解代谢产物相结合,导致相应酶类的过量生产。
三、其他类型突变株
组成型突变株(constitutivemutation):
指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵的突变株。
(即在没有诱导物的情况下就能正常合成诱导酶)
温度敏感突变株(temperaturesensitivemutation):
是指正常微生物经诱变后,只能在低温下正常生长,而在高温下却不能生长繁殖的变株。
第三节 生产菌种的选育方法(2学时)
一、发酵工业中的常用微生物
(1)细菌(图片展示);
(2)放线菌(图片展示)
(3)酵母菌(图片展示);(4)霉菌(图片展示);(5)其它
二、新菌种的分离与筛选
向保藏机构购买
发酵工业菌种获得的途径从自然界分离筛选
从生产水平高的批次中分离筛选
(一)自然界分离筛选菌种的步骤
样品采集→预处理→富集培养→初筛→复筛→发酵性能鉴定→菌种保藏
1.样品采集
(1)原则:
样品来源越广泛,获得新菌种的可能性越大。
(2)方法:
①土壤的有机质含量和通风状况(5~25cm深度);②土壤的pH和植被状况;③地理条件;④季节条件。
2.样品的预处理
(1)物理方法:
热处理;膜过滤;离心法。
(2)化学方法:
几丁质分离放线菌;CaCO3稳定pH分离嗜碱性的放线菌。
(3)诱饵法:
石蜡;花粉;蛇皮;毛发等。
3.富集培养
(1)控制培养基的营养成分;
(2)控制培养条件。
4.菌种分离
(1)平板划线分离法(重点!
);
(2)稀释分离法(重点!
);(3)涂布分离法;(4)毛细管分离法;(5)小滴分离法
2.2.5菌种初筛和复筛
(1)初筛(定性——粗放):
平板筛选(几十甚至几百个)
(2)复筛(定量——精确):
摇瓶筛选(2~3株)
三、菌种的改良及工程菌构建
菌种的改良:
采用各种手段(物理、化学、工程学、生物学方法)处理目的微生物菌种,使其遗传基因发生变化,使生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导,使某些代谢产物产量积累,从而获得生产上所需要的高产、优质和低耗的变异菌种。
(一)改良的目标
(1)提高目标产物的产量;
(2)提高目标产物的纯度,减少副产物;
(3)改良菌种性状,改善发酵过程;
(4)改变生物合成途径,获得高产新产品。
(二)改良的方法
1.常规育种:
诱变+筛选
2.其他育种方法:
细胞工程、基因工程、蛋白质工程、代谢工程育种等。
(1)杂交育种(cross-breeding):
指将两个基因型不同的菌株经结合(两个性别不同的微生物之间接触,遗传物质转移、交换、重组,形成新个体)后使遗传物质重新组合,从中分离筛选出具有新性状菌株的一种育种技术。
(2)原生质体融合(protoplast):
指用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁,制成由原生质膜包被的裸细胞,然后用物理、化学或生物学方法,诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合,经过染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
(3)基因工程育种(geneticengineeringbreeding)是一种全新的育种技术。
工程菌(engineeringbacteria)是采用基因工程技术将多种微生物的基因从细胞中取出,然后组装到一个细胞中,使这个菌株具有多功能、高效和适应性强等特点的新型微生物。
四、菌种的鉴定
(一)鉴定工作的内容
(1)测定一系列必要的鉴定指标;
(2)查找权威鉴定手册,确定菌种类型
(二)鉴定方法
(1)经典的分类鉴定方法:
形态学特征;生理生化特征;血清学试验与噬菌体分型;氨基酸顺序和蛋白质分析
(2)现代分类鉴定方法:
微生物遗传型;细胞化学成分;数值分类法
第四节 菌种的保藏及扩大培养(2学时)
一、菌种的保藏
菌种保藏(culturepreservation):
指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上,将菌种妥善保存,使之达到不死、不衰、不污染,以便于研究、交换和使用的目的。
保存程序:
挑选典型菌种的优良纯种(最好采用休眠体)→创造适合长期休眠的环境条件(低温、干燥、无氧、缺乏营养等)
保藏方法
保藏原理
适用菌种
保藏期
优点
缺点
斜面低温
低温
霉菌,放线菌,酵母菌,细菌均可
霉,放线菌及芽孢菌4-6月;酵母3月;无芽孢菌约1月
简便有效,适合非长期保藏的菌种
保期短,传代频繁,易变异
矿油保藏
低温、
缺氧
同上
霉,放线菌,芽孢菌2年以上,酵母1-2年,无芽孢细菌约1年
简单,不需特殊设备,且不需经常移种
直立保存,不便携带
沙土保藏
低温、缺氧、缺营养
产孢霉菌、放线菌以及芽孢细菌
2-5年
简单易行
工作量大
冷冻真空干燥
低温(-20下)、干燥、缺氧
除少数不产孢子只产菌丝体的丝状真菌外均可
5-10年
保藏期长,成活率高
需特定设备,操作繁琐
液氮超低温
超低温(-150~-196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备,操作复杂
二、菌种的衰退和复壮
(一)菌种衰退
1.菌种衰退(degeneration):
又称菌种退化,是指在生产菌种或筛选出来的较优良菌株,由于进行接种传代或保藏之后,群体某些形态特征及生理特征逐渐减退甚至完全丧失的现象。
2.菌种退化的主要表现:
①目的代谢产物合成能力下降;②产量下降;③糖化力或发酵力下降。
3.导致菌种退化的原因:
①基因突变(退化的根本原因)
自发突变频率:
10-8~10-5;诱变突变频率:
10-6~10-3
②连续传代(加速退化的直接原因)
4.防止衰退的措施:
①尽量减少传代次数;②选择合适的培养条件;③利用不同类型的细胞进行传代;④选择合适的保藏方法;⑤幼龄菌培养
对于诱变菌种的退化:
高效诱变剂/纯化
(二)菌种的提纯与复壮
1.提纯
纯度
操作方法
适用情况
菌落纯
稀释平板法、划线法、表面皿法
退化不严重
菌株纯(细胞纯)
单细胞分离法(或二者结合)
退化不严重
2.通过寄主体进行复壮
主要针对寄生性微生物菌株的退化,如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等。
3.改变培养条件,淘汰已衰退的个体
举例:
细黄链霉菌的分生孢子,采用-30℃~-10℃处理5~7d,死亡率达80%,再挑存活菌株。
三、菌种的扩大培养
目的:
提供相当数量的代谢旺盛的种子。
任务:
不但得到纯而壮的,而且获得活力旺盛的接种数量足够的培养物。
(一)实验室种子制备
1.孢子制备
菌型
营养特点
培养温度
培养周期
细菌
C源限量而N源丰富
37℃
菌体1-2d,产芽孢5~10d
霉菌
大小玉米、麸皮等天然农产品
25~28℃
4~14d
放线菌
琼脂斜面(麸皮、浸汁、蛋白胨)
28℃
5~14d
2.液体种子制备
摇瓶液体培养法:
孢子或菌体→液体培养基→摇瓶恒温培养→摇瓶菌(丝)体
(二)生产车间种子制备
(1)培养基(原料质量与组分)
(2)培养条件(温度、湿度、pH等)
T
过高
菌丝过早自溶
过低
生长繁殖缓慢,延长发酵周期
pH
适当
获得最大比生长速率和适当的菌量
DO
通气
保证有适宜的溶氧,满足正常代谢
搅拌
过度易产泡;酶氧化;增加染菌和能耗
H2O
干
孢子生长快
湿
孢子生长慢
(3)接种量和菌龄
1过老:
菌丝多但老化,进罐后易自溶,产量↓
2过嫩:
延迟期延长,菌丝量↓,发酵异常
3过多:
生长过快,黏度↑,DO↓,易衰老后劲不足,合成产物量↓
4过少:
延长发酵周期,异常形态,易染菌
(4)泡沫(通气搅拌)
1与生长和酶的合成有关
2产泡原因
(5)染菌控制
设备、管道、阀门漏损;灭菌不彻底;空气不净;无菌操作不严;菌种不纯。
(6)种子罐级数
一级种子:
孢子或菌丝→小种罐→培养→一级种子
二级种子:
一级种→较大种罐→培养→二级种子
三级种子:
二级种→大种罐→培养→三级种子
少:
简化工艺及控制;染菌机率↓;发酵波动↓;消毒等工作量少
多:
变异机率↑;工艺控制复杂;工作量大
第五节 发酵培养基的设计(2学时)
一、培养基的类型
依据
类型
特点
按营养物质的来源
天然
异养生长,营养丰富,价廉;组分含量不定
合成
定量工作研究用,生长慢,营养成分简单
半合成
大多数微生物均能生长、繁殖
按培养基形态
液体
培养种子和发酵时用
固体
用于孢子培养,菌种分离、保藏、观察、计数、鉴定等
半固体
液+琼脂,菌种分离及鉴定,微好氧细菌的培养或运动能力确定
按生产用途
斜面
供保藏菌种或产孢子用,C、N(尤其有机氮)浓度要适合
种子
供摇瓶种子或生产用,半合成为主,营养丰富、完整
发酵
供菌体生长繁殖和最大限度地获得目的产物用的
按培养基功能
选择
不妨碍目的M生长,而抑制非目的M生长
鉴别
加营养物或化合物,将对象M与其他M区别
二、发酵培养基的组成
培养基:
是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料。
培养基的基本要素:
碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长调节物质。
成分
功能
来源
碳源
为细胞提供能源及组成菌体细胞成分的骨架;提供菌体合成目的产物的原料,构成代谢产物
糖类、脂类、有机酸、低碳糖、石油、天然气、CO2等
氮源
组成菌体细胞结构物质;合成含氮代谢产物;提供微生物能量
有机N:
豆/棉子饼、麸皮、玉米浆、酵母、酒糟等
无机N:
氨水、铵盐、硝酸盐等
无机盐和微量元素
构成菌体成分;作酶的组成或激活剂;调渗透压、pH、电位等
P、Mg、S、Fe、Na、Cl、Zn、Co、Mn等盐及微量元素
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