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生物有机化学氨基酸的分析方法综述
生物有机化学氨基酸的分析方法综述
AReviewonAminoacidAnalysisMethods
摘 要:
氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。
本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。
关键词:
氨基酸 分析方法 综述
Abstract:
Theanalysismethodsofaminoacidsareveryimportantinreamofindustry,agricultureandlifescience.In
thispaper,theanalysismethodsofaminoacidarereviewed,withfocusonchemistrymethod,spectrophotometrymethod,
chromatographymethodandelectrochemistrymethod.
Keywords:
aminoacids;analysis;review
1 前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。
作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。
各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱(IEC)[1]、高效液相色谱(HPLC)[2]或气相色谱(GC)[3]等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。
然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱,自身又无荧光,因此不能直接检测。
通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。
电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。
本文对近年来各种化学方法分析氨基酸已获得的进展进行评述。
2 氨基酸的直接电化学分析
对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分析法[4]。
使用循环伏安法[5]可以直接测定L-半胱氨酸,在pH值小于7的磷酸盐缓冲溶液中,在金电极上于0.96V处有一氧化峰,在-0.75V左右有一还原峰,氧化峰和还原峰的峰电流的大小与半胱氨酸的浓度成正比。
有研究报道,不经衍生化处理,可以直接检测色氨酸和酪氨酸的含量,分别置聚酰胺修饰的碳糊电极于以0.2mol/LHCl-CH3COONa(pH=3.0)为底液的色氨酸和酪氨酸溶液中,从0.5V-1.50V进行循环伏安扫描,色氨酸和酪氨酸分别在0.94V和0.92V呈现一个稳定的氧化峰,随扫描次数的增多,两个氧化峰的峰电流都减小,结合2.5次微分技术,色氨酸和酪氨酸的检测限可达到0.024mol/L和0.034mol/L,相对标准偏差分别为5.2%和7.%。
3 氨基酸的间接电化学分析
3.1 通过衍生化反应间接测定多数氨基酸于金
属电极上是非电活性的,无法直接测定,一般是采用衍生化反应[6]将其转化成电活性的物质进行间接测定。
例如,赖氨酸是非电活性的,但将其与芳醛进行衍生化反应后,在约0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液中(pH=11)衍生产物于峰电位-1.12V处在滴汞电极上生产生一灵敏吸咐还原波,导数波高与赖氨酸浓度有良好的线性关系,检测限为3×10-8mol/L。
莫健伟等人研究了精氨酸、赖氨酸、组氨酸等多种碱性氨基酸与水杨醛在BrittonRobinson(B-R)缓冲溶液中的衍生化反应,衍生产物在-1.1V~-1.6V(Vs.SCE)电位范围有灵敏的极谱行为,并且发现这种行为与氨基酸的结构有关。
氨基酸与水杨醛的反应是亲核加成反应,反应的氨基氮原子的电子云密度愈高或醛基碳原子的电子云密度越低,越有利于活性席夫碱的形成,而有利于低浓度氨基酸的测定。
3.2 通过氨基酸与金属离子配位间接测定氨基
酸作为配体,可与多种金属离子配位,形成电活性的配合物,以提高氨基酸自身的检测灵敏度。
如酪氨酸在pH为3.94的B-R缓冲溶液中,在玻碳电极上于1.20V处出现一氧化峰,们灵敏度较低,加入少量Cu2+后,此峰消失,在0.95V处有一新的氧化峰出现,且灵敏度提高了2倍多,用新极谱法测得酪氨酸浓度在0.3~3mg/L范围内与氧化峰的2.5次微分值呈线性关系,检测下限为0.2mg/L。
Gilbert等人使用CO2+:
-催化半胱氨酸产生氢波来测定胱氨酸和半胱氨酸的灵敏度很高。
胱氨酸在碱性溶液中被还原成半胱氨酸,半胱氨酸在Co2+一氨体系中与Co2+络合,于滴汞电极上-1.55V处产生—催化氢波,波峰高度与脉冲幅度有关,当用10mV和30mV的脉冲时,其检测限分别为5×10-8mol/L和5×10-9mol/L。
彭爱红等人用极谱法研究了酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、组氨酸,(His)与Ni2+在硼砂
缓冲溶液中(pH=9.2)配位后的情况,在-0.6~-1.60V电位范围内扫描,峰电位分别为-1.04V、-1.20V、-1.34,三种氨基酸的峰电流与浓度分别在2.0×10-5~3.0×10-4mol/L、3.2×10-6~2.2×10-4mol/L、4.0×10-5~2.5×10-4mol/L的范围内呈线性关系。
3.3 通过电致化学发光分析电致化学发光(ECL)
以其独特的优点在分析当中的应用越来越广泛。
ECL[7]是具有电致化学发光活性的物质处于一定的电位时,与溶液中存在的氧化还原性物质作用生成的不稳定激发态回至基态时所产生的化学发光。
目前,采用ECL或免疫电化学发光(IECL)手段对各种氨基酸及蛋白质分析的报道较多。
联吡啶钅了[Ru(bpy)32+]化合物是一种典型的ECL活性物质,它与氨基酸发生ECl反应,发出一定强度的光测定氨基酸。
4 色谱法
4.1 衍生化离子交换色谱法
氨基酸自动分析仪的分析原理是基于阳离子交换树脂分离—柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。
该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液为流动相,在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测,具有重现性好、仪器稳定、结果可靠等优点,适合于大量常规样品的分析。
另外,由于衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离之后,因而避免了其他物质的干扰,适合未知复杂样品中氨基酸的分析。
其缺点是仪器复杂,体积大,费用高。
此外,由于脯氨酸的测定波长为440nm,而其他氨基酸的测定波长为570nm,因此脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。
4.2 衍生化高效液相色谱法
柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点,已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。
柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/弱酸盐缓冲液为流动相。
常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、萘-2,3-二甲醛(NDA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)异硫氰酸苯酯(PITC)、丹酰氯(Dansyl-Cl)]、4,4-二甲胺基偶氮苯-4′-磺酰氯(DABS-Cl)、6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC)]和2,4-二硝基氟苯(DNFB)[8]]等。
OPA衍生化方法具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的优点,而且试剂本身不发荧光,不会干扰氨基酸的测定;缺点是OPA不能和仲氨酸反应,与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定。
FMOC衍生化方法灵敏度高,反应快速,FMOC能仲氨酸反应;缺点是衍生副产物干扰测定,需用戊烷将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应并避免衍生物的水解。
PITC衍生试剂可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生副产物对测定无干扰,衍生物非常稳定(在干燥条件下可在冰箱中长期储存);缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸)形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定,不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸,样品制备需较长时间(30min以上),衍生化反应过程中需真空蒸发装置,不利于衍生反应
的自动进行。
Dansyl-Cl方法具有衍生反应迅速、样品制备简单、灵敏度高和剩余衍生试剂不需除去等优点;缺点是流动相中的杂质和衍生副产物对测定有干扰。
DABS-Cl方法可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生物在室温条件下稳定,检测波长在436~460nm处仍有较高
的专属性和灵敏度;缺点是与一些氨基酸(精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸)不能进行定量反应,而且产物成分复杂。
AQC方法适合于复杂样品中的氨基酸分析,具有灵敏度高、衍生物稳定等优点。
DNFB方法的优点有衍生产物稳定、操作简便、成本低等。
除了以上几种常见的衍生试剂外,还有几种新的改进试剂。
以异硫氰酸苄酯(BzITC)和异硫氰酸丁酯(BITC)为衍生试剂,其衍生物稳定,能同时测定半胱氨酸和胱氨酸,试剂有挥发性容易除去。
使用荧光衍生试剂N—羟基琥珀酰亚胺基-α-(92吖啶)-乙酸盐(HSAA),反应后剩余试剂无需萃取,产物稳定,有较高的专属性和灵敏度。
以二氢苊-5-磺酰氯(AcNSCl)为衍生试剂,其衍生物的荧光强度是Dansyl-Cl的10~25倍,而且衍生化反应速度比Dansyl-Cl的快115倍。
此
外还有使用多种芳基碳氧酰氯,包括4-苯基偶氮苄基碳氧酰氯(PAZ-Cl)、2-(萘甲基)碳氧酰氯(NMOC-Cl)等衍生试剂,对一些蛋白水解液进行分析,结果与FMOC方法一致。
4.3 柱前衍生化气相色谱法
气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱仪联用等优点。
氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极性基团,需要先对其衍生化。
衍生化方法有两种:
两步法和一步法。
两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化,然后再用各种酸酐将N-(O,S)基团乙酰化。
常用的衍生试剂有三氟乙酰(TFA)、五氟丙酰(PFP)、正丙醇、七氟丁酰(HFB)和异丙醇等一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳氧酰烃基酯[9]。
这种方法的优点是可同时将极性基团衍生化,反应可以在水溶液中进行,反应速度快,仅需几秒,衍生试剂便宜;缺点是不能与胍基、吲哚摹、咪唑基和羟基完全反应。
4.4 衍生化毛细管电泳法
毛细管电泳(CE)具有微量、灵敏和柱效高的特点,适合于氨基酸手性分离和复杂样品中的氨基酸分析。
用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式:
毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。
检测方式主要有紫外法和荧光法。
由于检测池的体积小和光路短,紫外法的应用受到一定的限制。
用在衍生化高效液相色谱法中的多数衍生试剂也适用于衍生化毛细管电泳法[10]。
在CE中常用的衍生试剂有OPA、NDA、Dan2syl-Cl、FMOC、二氢荧光素异硫氰酸酯(FITC)、3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉羧基甲醛(CBQCA)等。
此外用于激光诱导荧光法的衍生试剂有四甲基罗丹明硫代氨基甲酰(TR、9-氰基-N,N,N′-三乙基-N′-(琥珀酰亚胺碳氧酰苯基)焦宁氯(CTSP)、1-甲基碳氧酰吲嗪-3,5-二醛(IDA)、3-(对-羧基苯基)喹啉-2-羧醛(CBQ)、二羰菁琥珀酰亚胺酯(DCC)[11]等。
衍生化毛细管电泳法除了可以进行柱前衍生化外,还可以进行柱内和柱后衍生化。
朴内衍生化要求反应速度快,一般采用串联或“夹心饼”两种形式进行,具有试剂和样品用量少的优点。
Ewing研究小组曾采用柱内衍生化方法测定了一个单细胞中的10~18mol水平的氨基酸。
柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他化合物对衍生反应的干扰,缺点是柱后反应装置体积大,会引起色谱峰变宽而降低分离效果。
Albin等设计了一种裂口装置(gapjunction)将分离柱和反应柱连接,利用电渗流(EOF)将衍生试剂引入。
Gilman等利用裂口的扩散作用,将衍生试剂与毛细管内溶液混合而不影响分离。
柱后衍生还有其他的连接方式,如多孔渗管连接技术和不受驱动电压影响的同轴毛细管反应管。
4.5 氨基酸直接分析法阴离子交换色谱积分脉冲安培法
氨基酸直接分析法无需对氨基酸进行衍生化,可直接对氨基酸进行分离测定。
1999年Clarke等采用阴离子交换色谱—积分脉冲安培法[12]直接对蛋白水解液中的氨基酸进行分析,成功地测定了22种基本氨基酸,检出限达到pmol水平,分析结果与茚三酮法一致。
该法的基本原理是利用氨基酸在碱性流动液中的羧基阴离子在阴离子交换树脂上的保留进行分离;在pH>12的溶液中,伯胺和仲胺化合物能够在金电极上被氧化,采用积分脉冲安培法检测。
Cheng等使用一次性金电极分析氨基酸,克服了金电极容易污染的缺点。
5 展望
阳离子交换色谱分离—柱后茚三酮衍生化方法[13]作为经典的氨基酸分析方法,以其可靠性和可自动化经历了时间的考验。
柱前衍生化高效液相色谱法以其灵活和易于推广的特点,逐渐取代了传统的茚三酮方法。
气相色谱法具有分离时间短、柱效高、易于联用的优点。
毛细管电泳以其微量化、柱效高、分离能力强的特点,在微量样品分析和氨基酸手性拆分方面具有明显的优势,广泛用于生命科学等领域。
高效阴离子交换色谱—脉冲积分安培法是近几年发展起来的氨基酸分析法,其无需衍生的特点,给氨基酸分析带来重大变革,避免了衍生化方法引发的许多问题。
以上氨基酸分析方法在不断发展的同时,还存在许多问题,例如蛋白质的水解问题,当前还没有一个简单有效的水解方法适合于所有的氨基酸分析。
另外,复杂样品中的干扰物质也是影响氨基酸分析结果的重要因素。
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