提高显微镜分辨率的方法简述.docx
- 文档编号:11180032
- 上传时间:2023-05-29
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:39.97KB
提高显微镜分辨率的方法简述.docx
《提高显微镜分辨率的方法简述.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《提高显微镜分辨率的方法简述.docx(12页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
提高显微镜分辨率的方法简述
目录
1选题背景1
2方案论证及过程论述1
2.1像差1
2.1.1球面像差1
2.1.2慧形像差2
2.1.3色像差2
2.2照明对显微镜分辨率的影响2
2.2.1非相干光照明2
2.2.2相干光照明2
2.2.3部分相干光照明3
2.2.4临界照明3
2.3衍射3
2.3.1对两个发光点的分辨率3
2.3.2对不发光物体的分辨率4
2.4光噪声6
3结果分析6
4结论7
4.1提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法7
4.1.1提高光学显微镜分辨率的方法7
4.1.2如何提高电子显微镜分辨率7
参考文献9
1选题背景
显微镜是实验室最重要的设备之一,对观察微小物体细节的显微镜来说,评价光学显微镜及电子显微镜的重要指标之一是分辨本领。
显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力,它主要是显微镜的性能决定。
通常是以显微镜的分辨率级即显微镜能分辨开两个物点的最小距离d来表示,d值越小,则显微镜的分辨能力越强。
人眼本身就是一台显微镜,在标准照明条件下,人眼在明视距离(国际公认为25cm)上的分辨率约等于1/10mm。
对于观察两条直线来说,由于直线能刺激一系列神经细胞,眼睛的分辨率还能提高一些,这就是显微镜的分划板使用双线对准的原理所在。
人眼的分辨率只有1/10mm,那么比1/10mm小的物体或比1/10mm近的两个微小物体的距离,人眼就无法分辨了。
这时人们开始研制出放大镜和显微镜,显微镜的分辨率计算公式为:
d=0.61入/NA;式中:
d为分辨率(μm);入为光源波长(μm);NA为物镜的数值口径(也称镜口率)。
造成显微镜光学像欠缺的因素主要在物镜组,有像差、衍射和光噪声等,它们是影响显微镜分辨率的主要因素,其次照明对显微镜的分辨率也有一定的影响。
对于显微镜的使用者来讲,应该对造成显微镜分辨率下降的因素有比较清楚的认识,并知道克服和减少这些因素的方法。
本文从几何像差、色像差、衍射、干涉和照明几个方面分析了对显微镜分辨率的影响,指出了孔径数的增加,从衍射角度看对显微镜分辨率的提高有好处,但从几何像差的角度看则会降低显微镜的分辨率;并指出了照明对显微镜分辨率的影响是不可忽略的等。
2方案论证及过程论述
2.1像差
像差可分为单色像差和色像差两大类。
单色像差有五种:
(1)球面像差;
(2)彗形像差;(3)像散;(4)像场弯曲;(5)畴变。
其中
(1)和
(2)是由大孔径引起的,(3)、(4)、(5)是由大视场引起的。
显微镜需要大孔径,但不需要大视场,所以显微镜的单色像差主要是
(1)和
(2)。
2.1.1球面像差
单球面公式只有在满足近轴光线的条件下才能成立。
当孔径较大时,有许多远轴光线也进入了透镜,近轴光线和远轴光线经透镜折射后不能在同一点上会聚。
换句话说,主轴上一物点经透镜成像后,像不是一个点,而是一个圆斑,这样就产生了球面像差。
消除的方法有二:
一是在透镜前加一光阑,用以限制远轴光线的进入。
这样做,会使显微镜的孔径数降低,从而降低了显微镜的分辨率。
二是用复合透镜法,显微镜物镜就是
采用这种方法制作的。
2.1.2慧形像差
傍轴物点.它正适用于显微镜发出的宽阔光束经透镜后在像平面上不再交于一点,而是形成如彗星样的亮斑,称为慧形像差。
球差和慧差往往混在一起,只有当轴上物点的球差已消除时,才能明显地观察到傍轴物点的慧差。
2.1.3色像差
由于折射率随颜色、波长而变,同一物点不同颜色的光所成的像,无论位置和大小都不同,这样就产生了色像差。
消除的方法是采用消色差透镜组,即用冕牌玻璃的凸透镜和火石玻璃的凹透镜组成复合透镜。
当把由几何光学计算得到的几何像差和色像差基本消除后,由于存在衍射效应,理想成像条件仍不能满足。
2.2照明对显微镜分辨率的影响
2.2.1非相干光照明
瑞利判据的前提就是两光点的光是非相干光。
一般我们讨论的两光点都是自然光,这样,由两点发出的光在像面上叠加时,遵守强度叠加法则。
当一个物点(点光源)在像平面上产生的爱里斑的中心正好落在近傍的第二个物点(点光源)所产生的爱里斑的边缘上时,则说它们是显微镜刚能分辨的两个物点(点光源),绘出两物点(等亮度)间隔为瑞利间格(即后面(8)式中的d)时两个爱里斑的重叠情况,就能得到合强度曲线,这曲线在两个峰值的中间有一个凹陷,其最低点的强度Ic等于峰值Io的0.735倍,即:
Ic:
:
Io=0.735:
1
这可以看作是瑞利判据的强度表述:
若在两个点像的中央,合成强度分布有26.5%的下陷,则我们说对应的两个物点刚刚能被分辨。
2.2.2相干光照明
用发自一点的单色光来照明标本,从标本上相邻两点发出的光是相干光。
在两物点间隔为瑞利间格时,将像的强度曲线绘制出来。
这时我们看到两个像点中央的光强度没有凹陷,反而高出原最大值的47%。
为什么会这样呢?
是因为相干光照明引起的。
当两物点(点光源)发出的光是相干光时,在像平面上是振幅相加(干涉)而不是强度相加。
为了对相干照明下的两物点也规定一个分辨标准,并且这个标准对不同的相干性照明都适用,比照瑞利判据,我们采用像平面上光强曲线在两个峰值间有一个凹陷,其最低点的光强等于峰值的0.735倍,这时我们认为对应物平面上的两点是刚好能被分辨的。
于是,增大两物点间距,使像平面合强度曲线有26.5%的中央凹陷,经计算:
d'=0.77λ/NA
(1)
此距离d'即为最小分辨距离。
2.2.3部分相干光照明
实际显微镜的照明都是部分相干的,完全的相干照明只是极限情况,而完全的非相干照明只存在于一些特殊的距离。
对于部分相干照明来说,分辨本领介于相干情形和非相干情形之间,其最小分辨间隔可以表示为:
d〞=Cλ/NA
(2)
系数C介于0.61和0.77之间,它的值与相干度有关。
调节照明的相干度,可以在一定的范围内改变显微镜的分辨本领,改变的范围为:
(0.77-0.61)/0.61*100%=26.4%(3)
可见改变的范围为26.4%这个数值是不可忽略的。
2.2.4临界照明
无论点光源还是扩展光源,它们都是程度不同的相干照明。
让一个亮度均匀的光源紧靠在场阑的后方,并由聚光镜成像在物平面上,对物平面上的标本照明。
由光源上轴点发出的光受孔径光阑的限制,在聚光镜上的光锥截面是一个圆盘,它的半径以α表示,聚光镜到物平面的距离以L表示,其间的煤质折射率以n'表示,则爱里斑(相干区域)的直径为:
D=1.22λL/n'·α(4)
式中α是受孔径光阑限制的,增大光阑则D变小,于是相干度变小,分辨率提高,反之分辨率降低。
上式中L/n'·α近似和聚光镜的有效数值孔径N·A'成反比,
即有:
D∝λ/N·A'(5)
因此可以说,聚光镜的数值孔径控制照明的相干度,从而影响显微镜的分辨率。
2.3衍射
在衍射理论的基础上,应区分对发光点和非发光物体两种不同情况的分辨。
2.3.1对两个发光点的分辨率
按瑞利判据,在理想成像条件下,对于两个自发光点(即认为各点发出非相干光),在显微镜像平面上两个像点刚好能分辨开的最小距离d'应等于爱利斑的半径,即为:
d'≈1.22λl'/Dˊ=0.61λ/n'sinu'(6)
式中:
Dˊ——入瞳直径;
l'——像点至物镜(入瞳)中心的距离;
u'——物镜像方孔径角见图;
由于显微镜的成像满足正弦条件,即有
n·d·sinu=n'd'sinu'(7)
将上述正弦条件代入式(6)中,且有n'=1,则得到
d=0.61λ/n·sinu=0.61λ/NA(8)
上式中d即为显微镜物平面上能被分辨的两发光点的最小距离。
2.3.2对不发光物体的分辨率
实际显微镜中的成像情况要更为复杂。
通常被观察的标本并非自发观体,而是由外加光源与照明系统照明的。
标本各点的像是由光源(非点光源)发出的光线照射标本后,由标本上各点的散射或衍射形成的。
阿贝研究并创立了不发光物体的成像理论。
按照这一理论,当用显微镜观察被照明物体的精细结构时,物体对所通过的光束的作用类似于衍射光栅,因此衍射作用对于像的形成具有决定意义。
阿贝所建立的不发光物体分辨率公式,就是选择由许多平行的明暗交替条纹构成的最简单的衍射作为显微镜的理想标本成像而导出的。
根据衍射理论,在垂直的相干光照明条件下,显微镜对不发光物体的分辨率为:
d=λ/NA(9)
在倾斜照明条件下,显微镜对不发光物体的分辨率为
d=λ/2NA=0.5/NA(10)
式中λ是所采用的照明光的波长。
表1-1是采用λ=0.555μm的绿灯照明时,按式(10)计算得到的不同数值孔径物镜的分辨率值。
表1-1不同数值孔径显微物镜的分辨率值
干系物镜
油浸物镜
NA
0.100.300.650.95
1.251.40
d(μm)
2.750.920.420.29
0.220.20
式6~10表明,显微镜的分辨率具有波长的数量级,其具体数值取决于照明光的波长和显微镜的数值孔径。
因此,为提高分辨本领,可采用短波长的光照明。
例如,紫外线显微镜、x射线显微镜以及电子显微镜等都是提高显微镜本领的有效途径。
提高分辨本领的更主要途径是增大显微镜的数值孔径,即可通过提高物方折射率和增大物方孔径来达到。
以透射式生物显微镜为例,对于物方(盖玻片与物镜前透镜之间)介质为空气的物镜(通常为干洗物镜),其最大数值孔径为1,对应的物方孔径角μ0(即玻璃-空气界面上的全反射临界角)约为41°实际上干系物镜的数值孔径最大不能超过0.95,由n0·sinu0=n·sinu可知,其相应的u0和u角的值分别为39°和72°(见图1-1);增大数值孔径的另一个重要手段是增大n值,使之大于1。
为此采用浸液物
镜,即在盖玻片和物镜的前透镜之间充以液体,如图1-2所示。
当以水作浸液时,在盖玻片与浸液的界面上发生全反射的临界角约为61.5°,由工作距离和透镜直径所确定的角u值实际上可以达到64°,因而水浸物镜的最大数值孔径可达
NA=n·sinu=1.33×sin64°=1.20
实际上更多采用的是n=1.5~1.6浸油,如甘油(n=1.455)、杉木油(n=1.515)等。
其中,以杉木油用得最多,因其折射率与盖玻片及物镜前透镜基本相同,光线在界面上既不产生折射,也不产生全反射。
此时,最大孔径角u可达67°,相应数值孔径可达1.40;进一步采用高折射率浸油(如二碘甲烷n=1.741)可使数值孔径最高达到1.6。
比较图1-1和图1-2可以看出,采用浸液物镜比采用干系物镜可以得到更大的数值孔径。
图1-1
图1-2
但是,当提高孔径数时,从前面的像差分析可知,球面像差、慧形像差都会变大,反而降低了显微镜的分辨率。
2.4光噪声
各种不传递有关物体信息的光都属于光噪声,如由于在玻璃表面内反射所造成的杂散光和由于灰尘微粒或玻璃中的小气泡引起的散射光,也包括不均匀的照射光的起伏部分等等。
由于光噪声是不传递标本信息的,所以它的存在就一定程度上影响到了标本上两靠近点的分辨,也就影响到了其分辨率。
3结果分析
从上面的讨论中,我们知道,无论是几何像差、色像差,还是由于圆孔(透镜)产生的衍射,都会使得点物不能成点像,而是成为一光斑。
它们在不同程度上使得相互靠近的两物点无法分辨。
早期来说,因像差和杂散光引起的像的不完善完全掩盖了由衍射引起的像的模糊。
现在,由衍射以外的其它原因引起的像的不完善性已减到很小。
当仪器恰好在设计条件下运行时,衍射就成为实际的也是理想的极限了。
因此在介绍显微镜的分辨率的时候,一般书上只涉及物镜的圆孔衍射,而不再考虑像差和杂散光等。
从公式(8)可以明显看出,提高孔径数就能提高分辨率。
或者说,物镜越靠近标本、物镜和标本间填充物(透明)的折射率越高,则显微镜的分辨本领越高,这是适合高放大率部分的。
在低倍部分,我们从显微镜上能看到,物镜的倍数越小,它离标本的距离越大。
为
什么?
因为孔径数越大,几何像差就越大,显微镜的分辨本领就越低。
这和(8)式的结论正好是相反的。
由于放大倍数较低,通过牺牲孔径数来减少像差是比较合算的。
这样既满足了设计要求,又使成本降到了最低。
总之,影响显微镜分辨率的以上几种因素是始终存在的,通过合理的设计和组装,才能达到最佳要求。
另外,照明对显微镜分辨率的影响也是不可忽略的,因为它对分辨率的改变范围达到了26.4%。
4结论
4.1提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法
电子显微镜是显微光学一次革命,它使显微光学的最小分辨间距从0.2μm提高到0.2~0.3纳米,使人类能够看到一排排原子阵列的晶格结构,从而极大地提高了人类研究微观世界的能力,而光学显微镜和电子显微镜最大分辨率不同的原理使所使用的波长不同,前者使用可见光,分辨率最高达0.1微米级,最高放大倍率只能到1600倍左右。
后者使用电子,根据物质波波长理论,在几十千伏至几百千伏的电压加速下,可使电子显微镜的分辨率达到纳米级,比光学显微镜的分辨率高千倍。
4.1.1提高光学显微镜分辨率的方法
提高光学显微镜分辨率的方法根据分辨率的计算公式:
d=0.61入/NA,可知提高光学显微镜分辨率的方法有三种:
①减低波长。
可见光最短波长0.39μm,若用0.13μm的紫外线作光源,则会比普通显微镜提高3倍以上。
可是由于紫外线显微镜的透镜材料需特殊材质(透过紫外线的材料)制造,加之紫外线显微镜不能用肉眼直接观察,只能通过摄制显微镜照片进行分析,这样就限制了紫外线显微镜的应用。
②增大折射率。
一般显微镜的物镜分为低倍物镜(2×、4×、10×等)、高倍物镜(40×、45×等)、水浸物镜(63×)、油浸物镜(90×、100×)等。
低倍物镜也叫干系物镜,其介质是空气,折射率是1;水浸物镜介质是蒸馏水,其折射率为1.33;油浸物镜介质是香柏油或其它透明油,其折射率一般在1.52左右,接近透镜和载玻片的折光率。
水浸物镜和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用高折射率的介质,分辨率也高。
③加大物镜的镜口率来提高分辨力。
数值孔径(镜口率)公式为:
NA=n·sinα;式中:
n——物镜与标本之间的介质析射率;α——物镜的镜口角。
如低倍物镜指1×~6×,NA值为0.04~0.15;中倍物镜指6×~25×,NA值为0.15~0.40;高倍物镜指25×~63×,NA值为0.35~0.95;而油浸物镜指90×~100×,NA值可达1.25~1.40。
由此可见,那NA值越大,说明显微镜物镜的镜口率越大,d值越小,分辨力越高,物象越清楚。
4.1.2如何提高电子显微镜分辨率
电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小物体的。
物镜分辨力的高低与成像是否清楚有密切的关系。
而目镜没有这种性能,因为目镜只放大物镜所成的像。
为
此,提高电子显微镜放大率的方法可从以下几个方面考虑:
①保持良好的加速电压。
加速电压不能很低,正常应保持在20~30KV。
②尽量缩短工作距离。
工作距离不能太大,一般保持在5~8mm,以缩短探头接收信号的距离。
③保持好样品的倾斜度,样品倾斜10—150,使二次电子发射及接收的多。
④聚光镜放在600—650左右,(数值越大,束斑尺寸越小,分辨率越高)。
⑤对中良好,保证电子束对中,信号强,亮度好。
⑥及时更换新的灯丝,使灯丝饱和,束流稳定,并使束流值保持在100—150。
⑦物镜光阑合轴好(特征点在2000X倍以上时,基本同心聚焦散焦)。
⑧延长抽真空的时间以提高真空度(一般在30分钟以上基本达到平衡)或检查真空系统的密封状态。
参考文献
【1】郭嘉泰.冯若冰.周晋阳.影响显微镜分辨率的几种因素.中国医学物理学杂志.2003.10.第20卷第4期.
【2】胡玉华.胡玉芝.陈守清.如何提高显微镜的分辨率.品牌与标准化.2010
(2)
【3】李明.唐玄之.光学显微镜分辨率讨论时的一些问题.江苏教育学院学报(自然科学版).1985
(2)
【4】吴德邦.邹利元.对显微镜分辨率的几点.认识泸州医学院学报.1994(3)
【5】汤栋.透射电子显微镜分辨率的改进.电子显微学报.2004(4)
【6】姚启钧.光学教程.高等教育出版社.2011.5
【7】迟泽英.陈文建.东南大学出版社.2008.11
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 提高 显微镜 分辨率 方法 简述