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ICC
IF/ICCQ&A
免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂?
固定剂主要有两类:
一类是有机溶剂,如甲醇、乙醇、丙酮等。
它们通过强烈脱水变性蛋白,同时它们也能够溶解脂类物质,因此产生通透效应。
另一类为交联剂,如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等,它们导致细胞内分子相互连接成网状结构,从而维持在原位上。
这两类固定剂各有优缺点,交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构,但交联可能会破坏一些细胞组分的抗原性。
同时交联剂固定的细胞需要通透处理,才能让抗体穿越膜结构与胞内抗原结合。
醇类固定的优势在于蛋白变性完全,对抗原的保存性好,能充分暴露出抗原。
醇类固定的细胞不需要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法,先要考虑所检测抗原在细胞中的定位,通常膜组分的蛋白需要用多聚甲醛固定。
其他蛋白往往凭经验选择固定剂,可以试用两种方法,然后选择较好的一种。
免疫荧光,免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照?
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性,排除非特异性疑问,同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问题。
(1)阴性对照
阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色,当待检标本呈阳性结果时,阴性对照就更加重要,用以排除假阳性。
较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞,例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。
但这样的标本不一定存在或很难找到,常见的阴性对照也可以是针对一抗的PBS对照或来自同一种属动物的血清对照。
(2)阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色,这种阳性对照可验证Protocol,排除实验过程中出现的差错。
另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。
同时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签,如Flag,Myc,Histag等。
什么是免疫荧光双标记,怎么进行荧光双标实验?
免疫荧光双标记(DoubleImmunofluorescence)是用两种不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。
标记这两种抗体的荧光素具有不同的颜色(激发和发射波长不同),通过荧光显微镜可以在同一细胞上分别观察到两种抗原,并可通过图像处理软件将它们同时呈现在一张图片上。
由于在同一个样本使用两种染料,为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。
主要有两种方法能够达到这一目的。
最确定的方法就是直接标记一抗,如其中一种标记FITC,另一种标记Texas红,一般会有满意的结果。
第二种方法是应用两套种属特异性的检测试剂。
在进行这类进行荧光双标前,最好先验证单标对特定组织或细胞是有效的。
在操作上与单标方法并无不同,但两种一抗必须来源于不同种属的动物,且两种二抗不能存在交叉反应。
应该选择什么样的抗体进行免疫荧光及免疫细胞(组织)化学实验?
如果使用商业化的抗体,在使用之前要仔细阅读公司关于抗体的说明,该抗体是否能用来做免疫荧光或免疫细胞(组织)化学实验。
对于自己生产的抗体,在生产抗体时选用的免疫原对获得高质量的试验结果非常重要。
其次,就是单抗和多抗的选择问题。
这方面基本上遵循着通用的原则,多抗的优点是来源动物种属多,亲和力高,反应性广,可以识别抗原的多种亚型,缺点是特异性相对较差,有时容易带来假阳性结果,且抗体质量存在批次差异;单抗的最大优点是特异性好,质量稳定,但缺点是动物来源受限(绝大多数是小鼠),灵敏度较低,而且价格较高。
单抗对固定的容忍度不如多抗,因为它们识别的位点比较单一,更容易受到破坏。
免疫荧光实验中用于标记抗体的荧光素有哪些,在选择上有什么考虑?
以下列举几种常用的荧光素,更多的荧光素可以从相关网站上找到:
1.FITC(Fluorescein)Excitation495nm,Emission525nm,黄绿色荧光;
2.Rhodamine(TRITC)Excitation552nm,Emission570nm,橙红色荧光;
3.R-Phycoerythrin(PE)Excitation488nm,Emission578nm,橙红色荧光;
4.TexasRedExcitation596nm,Emission620nm,红色荧光。
选择荧光素主要考虑以下几点:
①高消光系数(extinctioncoefficient)和光子产量(Quantumyield),这意味着光捕获能力强和效率高;
②光稳定性较好;
③与常见光源和滤光器匹配性较好;
④不干扰抗体反映;
⑤水溶性以及pH稳定性。
此外,还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。
免疫酶标细胞(组织)化学中有哪些显色液,它们的各自特性是什么?
免疫酶标细胞化学中,由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色,无法直接观察,因而需借助于某些化学基团的呈色作用,使其得以显示,以利于在显微镜下观察。
常用的显色液有:
1.DAB(Diaminobenzidine;3,3-二氨基苯联胺)显色液
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法(如酶标法、PAP法等),是广泛应用的电子供体之一,较敏感,切片可脱水透明,半永久保存,且其终产物具嗜饿性,既可直接在光镜下观察,也可经OsO4处理后,增加反应产物的电子密度,适于电镜下确定抗原存在的部位。
但有几点需注意:
DAB溶解要完全,否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察;DAB浓度不易过高,否则显色液呈棕色,增加背景染色,另外DAB有致癌作用,应尽量减少吸入和接触次数,最好将DAB制成10倍贮存液,分装于-20℃保存,应用时稀释、过滤。
操作时应戴手套,尽量避免与皮肤接触,用后及时彻底冲洗,接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2.CN(4-Cl-1-Naphthol,4-氯-1-萘酚)显色液
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本,勿用酒精脱水。
与DAB比较,CN敏感性略差,但因其终产物较局限,很少弥散,光镜观察较为适合。
3.AEC(3-amino-9-ethyl-carbozole,3-氨基-9-乙基卡唑)显色液
该显色液作用后,阳性部分呈深红色,加以苏木精或亮绿等作为背景染色,则效果更佳。
由于终产物溶于酒精和水,故需用甘油封固。
AEC染色后的颜色比DAB好看,但是灵敏度比DAB低,而且保存时间短,易褪色。
4.TMB显色液
TMB即四甲基联苯胺(Tetrabenzidine)是一种脂溶性较强的基团,因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应,且由于这种高度的脂溶性,使其易形成多聚体,在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物,这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。
同时反应产物的沉淀,使得HRP的活性部位更加暴露,利于酶氧化反应进行。
TMB的反应产物为深蓝色,利于光镜观察,且反应产物越聚越大,常超出单个细胞器的范围(而DAB则被限制在其内),故TMB反应的检测阈较低。
由于上述优点,目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。
需要注意的是:
TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。
另外,TMB是一种较强的皮肤刺激剂,并有致癌的潜在可能,故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5.BCIP/NBT显色液
是碱性磷酸酶的显色底物。
BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。
NBT即四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。
当二者存在时,在碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)作用下,NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
有没有办法增强IF/ICC/IHC中的特异性染色,减少非特异性染色?
为了获得高质量的结果,在免疫染色中应特别注意增强特异性染色,减少或消除非特异性染色。
在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题:
1.增强特异性染色的方法
(1)蛋白酶消化法:
其作用是暴露抗原,增加细胞和组织的通透性,以便抗体与抗原最大限度的结合,增强特异性染色和避免非特异性染色。
这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色,常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶(pronase)等,也可用3mol/L尿素处理切片,达到酶消化的目的。
酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同,应根据酶的活性通过预试验确定,消化的时间还与组织固定的时间有关,一般是陈旧固定组织所需时间长,以37℃为宜,消化时间短的组织可在室温中进行。
消化处理时间过长能损伤组织,易使切片脱落,应使用切片粘附剂,消化时间尽量缩短。
(2)合适的抗体稀释度:
抗体的浓度是免疫染色的关键,如果抗体浓度过高,抗体分子远远多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。
此阴性结果并不一定缺少抗原,而是由于抗体过量。
这种现象类似于凝集反应中的前带效应(Prozoneeffect)。
因此,必须使用一系列稀释或作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度,以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。
抗体稀释度应根据:
①抗体效价,溶液中特异性抗体浓度越高,工作稀释度越高;
②一般讲,应用的抗体稀释度越大,温育时间越长;
③抗体中非特异性蛋白含量,只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色;
④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。
所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。
抗体的稀释主要是指第一抗体,因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,可减少或消除其中交叉抗体反应。
(3)温育时间:
大部分抗体温育时间为30-60min,必要时可4℃过夜(约18h)。
温育的温度常用37℃,也可在室温中进行,对抗原抗体反应强的以室温为佳。
37℃可增强抗原抗体反应,适用于多数抗体染色,但应注意在湿盒中进行,防止切片干燥而导致失败。
(4)多层染色法:
对弱的抗原可用间接法(双层)、PAP和ABC法(三层)、四或五层PAP法或ABC法,或PAP和ABC联合染色法等,可以很大程度的提高敏感性,获得良好结果。
(5)显色增敏剂的应用,如在过氧化物酶底物中加入氯化镍,可提高显色敏感度4倍。
2.减少或消除非特异性染色的方法
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色,最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。
最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:
5-1:
20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。
必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白,可进一步减少非特异性染色。
作用时间为10-20min。
也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。
有明显溶血的血清不能用,以免产生非特异性染色。
免疫荧光染色时,可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。
当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。
洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
如何判断免疫细胞(组织)化学实验的结果?
对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度,要准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果,必须严格对照实验。
染色结果呈阴性并非都是抗原不表达,要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关;对新发现的阳性结果,除有对照试验结果之外,应进行多次重复实验,要求用几种方法进行验证,如用PAP法阳性,可再用ABC法验证。
必须学会判断特异性染色和非特异性染色,对初学者更为重要,否则会得出不科学的结论。
特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位,如胞浆内,也有分布在细胞核和细胞表面的,即具有结构性。
特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。
非特异性染色表现为无一定的分布规律,常为某一部位成片的均匀着色,细胞和周围的结缔组织均无区别的着色,或结缔组织呈现很强的染色。
非特异性染色常出现在干燥切片的边缘,有刀痕或组织折叠的部位。
在过大的组织块,中心固定不良也会导致非特异性染色。
有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在,由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录,而且令人对其特异性结果产生怀疑。
阳性细胞具有如下的染色特征:
(1)阳性结果应定位在细胞中相应的部位,比如在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上,在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。
不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。
根据所检测抗原的不同,抗原分别定位在:
①细胞膜,如LCA和UCHL1等;②细胞质,如Keratin和Lysozyme等;③细胞核,如PCNA和ER等。
大部分抗原定位于细胞质(胞浆),可见于整个胞浆或部分胞浆。
(2)阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。
(3)由于细胞内含抗原量的不同,所以染色强度不一。
如果细胞之间染色强度相同,常提示其反应为非特异性。
(4)阳性细胞染色定位于细胞,且与阴性细胞相互交杂分布;而非特异性染色常不限于单个细胞,而是累及一片细胞。
(5)切片边缘、刀痕或皱折区域,坏死或挤压的细胞区,胶原结缔组织等,常表现为相同的阳性染色强度,但绝大多数是非特异性染色,不能用于判断阳性。
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