土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定.doc
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土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定.doc
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土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定
班级:
生物工程111班
姓名:
学院:
生命科学学院
组员:
指导老师:
钱黎明、林健聪
摘要:
通过各种分离、纯化和培养技术筛选有用菌株是微生物学实验技术中必须重点掌握的最常规、最重点的技术,同时也是生产和科研中常用的方法。
关键词:
筛选,提纯,产淀粉酶芽孢杆菌
引言:
芽孢杆菌是细菌的一科,能形成芽孢。
包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。
芽孢杆菌多为腐生菌,在土壤、水、空气以及动物肠道等复杂环境中大量存在。
芽孢杆菌抵抗力强,能在恶劣环境中休眠,遇到适宜温度再生长,较容易保存。
同时,芽孢杆菌代谢可以产生很多对人类的生产、生活有利的产物。
因此,从复杂环境中,筛选产生特定产物的芽孢杆菌对人类的生产、科研具有重大意义。
本实验以产淀粉酶的芽孢杆菌为例,培养同学们从复杂环境中分离、提纯菌体,并鉴定菌体特性的技能。
让同学们自行设计实验,分析数据,让同学们对所学的知识加深认识,为之后的学习、科研打好基础。
实验目的:
了解微生物分离和纯化的原理和常用方法和技术,掌握从土壤环境中筛选产淀粉酶芽孢杆菌的原理和技术,了解实验设计的方法,培养综合分析解决问题及判断实验结果的能力,熟练掌握所学过的微生物实验方法,进行综合技能训练。
实验原理:
自然环境中,微生物混居杂生。
稀释样品,加热土壤悬液杀死非芽孢杆菌,平板分离获得单菌落,了解芽孢杆菌属的主要特点,然后进行革兰氏染色、芽孢染色来判断菌株是否为芽孢杆菌,再经过淀粉水解实验,判断是否产淀粉酶。
芽孢杆菌属的共同特征是:
革兰氏阳性;接触酶阳性;水解淀粉;VP试验阳性;不产生吲哚;Pureculture是指只含有一种微生物的培养物。
纯培养分离技术,是指微生物的分离和纯化。
根据微生物对营养和生长要求设计培养基或者培养环境,或加入抑制物。
分离菌,是指进一步划线、纯化。
实验材料:
取样:
广州大学生化楼外走廊的楼道下的土壤
培养基:
淀粉牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,葡萄糖酵解培养基,乳糖酵解培养基,葡萄糖蛋白胨培养液,蛋白胨水培养液,西蒙斯氏柠檬酸盐培养基
试剂:
草酸铵结晶紫染色液、95%乙醇、5%孔雀绿溶液、石炭酸复红液、卢戈氏碘液、香柏油、二甲苯、甲基红溶液、40%KOH溶液、α-奈酚、乙醚、吲哚试剂
器材与仪器:
无菌玻璃涂棒、无菌吸管、移液枪、接种环、无菌培养皿、三角瓶、烧杯、洗瓶、载玻片、玻棒、试管、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、玻璃珠、杜氏小管等。
恒温摇床、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌箱、超净工作台、水浴箱、显微镜等
实验步骤:
1、初筛方法
①制菌悬液:
取10g土样,放入各自装有90mL无菌水的三角瓶,振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。
②梯度稀释菌悬液:
再分别另取装有9mL无菌水试管6支,用记号笔编上10-2、10-3、10-4。
取已稀释成10-1土壤液,振荡后静止0.5min,用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中,并在试管内轻轻反复吹吸数次,使之充分混匀,即成10-2土壤稀释液。
同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中,混匀后即为10-3土壤稀释液,依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。
在土壤稀释过程中,用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。
③加热筛选有芽孢的菌:
将10-2、10-3、10-4锥形瓶加塞、包扎、摇匀,利用恒温水浴装置80℃左右水浴,水浴锅温度恒定后维持20min,杀死非芽孢杆菌。
④涂布平板用一支新的无菌枪头,由低浓度开始,从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul,对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上,用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。
每个浓度做2个平板(重复)。
37℃下恒温培养24h。
2、复筛方法
划线接种:
在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线,先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条,再转动培养皿约60°角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线,再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。
划线完毕,盖上皿盖,倒置于37°C温室中培养约20h.。
第4次后,挑取部分出来进行革兰氏染色镜检和芽孢镜检,发现视野内出现大部分形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体,但有少部分杂菌。
继续进行第5次划线分离,获得较纯的菌种。
将纯化得到的单菌落分为两部分,其中一部分接种到培养基内,用以保存菌种,另一部分用来做染色实验。
革兰氏染色步骤:
涂片、干燥及固定
初染:
在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液,染1分钟,倾去染液,流水冲洗至无紫色。
媒染:
先用新配的路哥氏碘液冲去残水,而后用其覆盖涂面1分钟,后水洗。
脱色:
除去残水后,滴加95%酒精进行脱色约15-20秒,后立即用流水冲洗。
复染:
滴加番红染色液,染3-5分钟,水洗后用吸水纸吸干。
镜检:
油镜观察染色结果。
芽孢染色步骤:
取37℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌涂片,干燥,固定。
于涂片上滴人3~5滴5%孔雀绿水溶液。
用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热,自载玻片上出现蒸汽时,开始计算时间约4~5min。
加热过程中切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。
倾去染液,待玻片冷却后,水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
用石炭酸复红液复染lmin,水洗。
制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色,菌体红色。
(注:
观察芽孢的形状和位置,查伯杰细菌手册)
3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种:
上述划线接种后的菌落中,各挑取以18-24h的纯培养物接种于倒好的淀粉牛肉膏培养基中,一平板分2个区域,点接重复两次,在37℃培养箱中培养24h。
上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室,其他置于无菌室。
实验室里,四个平板均加入碘液,立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置,并可同时记录透明圈的大小。
根据所记录的阳性菌的编号,第三组和第四组菌产淀粉酶。
4.斜面保存菌种
取无菌斜面试管8支,将注有菌株名称和接种日期的标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2~3cm处。
每种菌接2管,标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应。
进行斜面接种,加塞、包扎好到37℃培养箱里培养24h。
5、各类生理生化鉴定
糖类发酵试验(葡萄糖、乳糖发酵)
用接种针将各种杆菌分别接种于数支两种发酵管内,标记,要与斜面菌种标记相对应。
两种发酵管各设一支不接种,作为空白对照。
注意接种的整个过程中,不能人为的制造气泡,若发酵管内有气泡,则轻轻甩动发酵管直至气泡消失。
若气泡不能退去,则该管作废应重做一管。
接种后,每一管外包一层无菌纸,以防污染。
接种完毕后,将全部发酵管倒置于干净小烧杯内,37℃培养24h。
与对照管比较,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该种糖,记录用“-”表示;如培养液呈黄色,反应结果为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸,记录用“+”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应,表明该菌分解糖能产酸并产气,记录用“+”表示;如杜氏小管内没有气泡为阴性反应,记录用“-”。
乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)
取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管,编号。
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中,空白对照管不接菌,置37℃恒温箱中,培养24h。
取出以上试管,充分振荡2min。
每管分别加入40%NaOH溶液10~20滴,并加等量α-奈酚,振荡试管,以使空气中的氧溶入,若培养液呈红色,记录为V.P.试验阳性反应(用“+”表示);若不呈红色,记录为V.P.试验阴性反应(用“-”表示)。
吲哚试验
取装有蛋白胨水培养液的试管,编号。
以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中,空白对照管不接种,置37℃恒温箱中培养24h。
观察记录,在培养液中加入乙醚1~2ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管,以防破坏乙醚层影响结果观察),如有吲哚存在,乙醚层呈现玫瑰红色,此为吲哚试验阳性反应,否则为阴性反应,阳性用“+”、阴性用“-”表示。
柠檬酸盐试验
取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基的试管分别标记待测菌种的编号和空白对照以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中,然后置于37℃恒温箱中培养24h。
观察结果,若培养基变蓝色,则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长,即为阳性反应,以“+”表示。
若培养基仍为绿色则为阴性反应,以“-”表示。
实验结果:
表1生化鉴定结果
试管编号
1
2
34
葡萄糖发酵
+
+
++
乳糖发酵
-
+
++
MR试验
+
+
++
VP试验
-
-
--
吲哚试验
+
+
++
柠檬酸盐利用试验
+
+
++
*注:
“+”表示阳性,“-”表示阴性
结论与心得:
这次实验,我们小组纯化了四个菌种,其中3.4号菌是产淀粉酶的。
由于时间问题,我们做的生化生理实验比较少,这是比较遗憾的。
但是我觉得在这个实验中,我的微生物技能提高了不少。
实验时的独立思考能力也得到了锻炼。
四个菌种都在葡萄糖发酵、MR试验、吲哚试验和柠檬酸盐利用试验中体现阳性。
1号菌种在乳糖发酵中表现为阴性,2、3、4号菌种表现为阳性。
在VP试验中全部表现为阴性。
这表示了在土壤中,微生物的多样性,可以分解多种物质。
这个实验总体来说,还是做得比较顺利的。
但是筛选菌体那一步有一点困难,因为菌种比较多,要分辨是否产淀粉酶的芽孢杆菌,步骤比较繁琐。
在这一步中,我发现原来我的芽孢染色和革兰氏染色都比较不熟练,过火时很容易就烧过了,导致着色过深。
不过多次染色下来,我也可以做得很熟练了。
本实验以小组为单位,培养我们的团体合作能力。
同时,要求同学们自行设计实验步骤,锻炼了我们自主实验的能力。
本实验从环境中筛选菌体,要求我们熟练掌握从复杂环境中分离、提纯微生物的常用方法,并结合这个学期前期学过的微生物其他技术,考察了我们在这个学期里学到的实验技能。
在筛选菌种时,我们要根据革兰氏染色、芽孢染色和淀粉水解试验验证是否产淀粉酶芽孢杆菌的特性,鉴定、筛选、提纯菌种,这要求我们有较好的分析数据的能力,也考验了我同学们的技术熟练度。
参考文献:
【1】周德庆.微生物学实验教程[M],北京:
高等教育出版社,2002.9
【2】伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:
科学出版社1984.
【3】唐丽江、王振华、王迪,产淀粉酶芽孢杆菌高产菌株的筛选[J],饲料博览,2009年第4期
【4】张双民,土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化[J],陕西师范大学生命科学学院,陕西 西安 710062
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- 土壤 中产 淀粉酶 芽孢 杆菌 筛选 及其 活力 测定