cellsearch循环肿瘤细胞CTC试剂盒说明书自译中文版.docx
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cellsearch循环肿瘤细胞CTC试剂盒说明书自译中文版
7900001
16人份试剂盒
CellSearch
循环肿瘤细胞检测试剂盒
(上皮细胞)
IVD
使用须知
本试剂盒仅用于体外诊断
CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞(CTC)的计数,这些细胞来源于上皮细胞,即表现为CD45阴性(CD45-),EpCAM阳性(EpCAM+),细胞角蛋白8,18阳性(CK8,18+)和(或者)CK19阳性(CK19+)的细胞。
用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC,存在于外周血中,这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。
因此,CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。
CTC应该进行持续检测,并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。
在肿瘤发生过程中的任何时间段,对CTC数量进行评估,可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。
*在该研究中,转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上,高于参考水平具有两次连续增加。
这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性,激素抗性,或去势抗性的前列腺癌。
摘要说明
肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后,这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。
血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞,而这类细胞在血液循环系统中是极罕见的。
基于此,本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS
AUTOPREP
System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH
Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。
用CELLTRACKSII分析仪或者CellSpotter分析仪,一种半自动荧光显微镜,可以对肿瘤细胞进行分析和计数。
这种方法只计具有上皮细胞特性(EpCAM+,CK8,18+,和/或者CK19+)的细胞数量。
检测原理
CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。
磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。
其表面包被识别EpCAM抗原的抗体,EpCAM是CTC特异性抗原。
因此,该磁微粒可以捕获CTC。
经过免疫捕获和富集后,荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。
荧光试剂包括以下组成:
抗CK-藻红蛋白(PE)的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体(上皮细胞特性);DAPI,用于细胞核染色;和抗CD45-别藻蓝蛋白(APC)白细胞特异性抗体。
试剂/样品混合物被CELLTRACKS
AUTOPREP
系统分配到一个插入在MAGNEST?
细胞呈现装置的暗盒中。
所述MAGNEST?
装置具有强磁场,能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。
CELLTRACKSANALYZERII?
分析仪,或者CellSpotter?
分析仪自动扫描暗盒的整个表面,获取图像并向用户显示所有事件,其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。
图像进行最终分类,并以画廊格式呈现给用户。
所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+,CK+,DAPI+和CD45-表型时,才被分类为肿瘤细胞。
试剂盒提供的材料
试剂说明
1.3ml包被抗EpCAM抗体的磁流体:
含有浓度为0.022%的磁微粒,这些磁微粒表面偶联有抗表皮细胞表面标志物EpCAM的鼠源单克隆抗体。
缓冲溶液中含有0.03%的BSA和0.05%ProClin300作为保护剂。
(棕色瓶盖)
2.3ml染色试剂:
包含细胞角蛋白特异性鼠源单克隆抗体,该偶联藻红蛋白(PE),浓度为0.0006%和浓度为0.0012%的鼠源抗CD45分子的单克隆抗体,该抗体偶联别藻蓝蛋白(APC),保存在含有0.5%BSA和0.1%叠氮化钠的缓冲溶液中。
(白色瓶盖)
3.3ml核酸染料:
浓度为0.005%的4',6-二脒基-2-苯基二盐酸盐(DAPI)保存在0.05%
的Proclin?
300缓冲溶液中。
(蓝色瓶盖)
4.3ml捕获增强试剂:
包含浓度为0.02%的专有试剂用于限制铁磁流体聚团,保存在0.5%BSA和0.1%叠氮化钠缓冲溶液中。
(透明瓶盖)
5.3ml通透试剂:
含有0.011%的专有通透剂,保存在0.1%叠氮化钠缓冲液中。
(绿色瓶盖)
6.3ml细胞固定液:
包含25%的专有固定液成分,保存在0.1%BSA和0.1%叠氮化钠缓冲溶液中。
(红色瓶盖)
7.2x110ml/瓶稀释液:
含有0.1%叠氮化钠的缓冲溶液。
8.16支Cellsearch?
圆锥形管(15ml圆锥形离心管)和管帽。
9.16个暗盒和暗盒塞子。
未提供的必需材料
1.CellSave血液保护管(货号#7900005)
2.CELLTRACKS
AUTOPREP
系统(Catalog#9541)
3.CELLTRACKSANALYZERII?
分析仪(Catalog#9555),或者CellSpotter?
分析仪(Catalog#9525)
4.CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞质控试剂盒(Catalog#7900003)
5.CELLTRACKS?
AUTOPREP?
仪器缓冲液(Catalog#7901003)
6.能提供离心力为800Xg水平离心机。
7.试管架
8.微量移液器和枪头
9.旋涡混合器
警告和注意事项
1.本产品仅用于体外诊断。
2.在使用本产品检测样本之前请仔细阅读说明书。
3.注意:
只能用CellSave保护管收集血液。
CTC非常脆弱,需要特别保护才能进行正确分析。
4.注意:
从业人员必须遵循全面防护措施,使用实验室的安全设备(例如,护目镜、安全服、安全手套等)。
5.注意:
微生物污染会造成获得结果的不正确性,实验中应避免生物污染。
6.警告:
所有的生物样本,包括暗盒和其他与生物样本接触的材料,应该认为具有生物危害。
样本如果具有传播感染的能力,必须进行及时处理。
同时,废弃物应根据当地和国家的规定进行正确处理。
禁止用嘴吸液。
7.警告:
一些含有叠氮化钠作为防腐剂的试剂。
如果食入,请立即就医。
应放在小孩拿不到的地方。
远离食品和饮料。
使用时,佩戴合适的防护服。
与酸接触会释放剧毒气体。
在处理过程中,叠氮化合物应用大量的水冲洗,并避免放置在铅或铜的容器中,其可形成爆炸的条件。
危险和安全术语R22表示吞咽有害,S28表示与皮肤接触后,用大量肥皂清洗。
8.警告:
所用包含Proclin?
300作为防腐剂的试剂。
过度暴露在Proclin?
300可引起皮肤和/或眼睛刺激,以及粘膜和上呼吸道刺激的症状。
9.操作人员在实验前应进行培训。
试剂储存和处理
1.所以试剂在未开启使用之前,请储存在2-8度。
2.在试剂盒开启后,试剂在2-8度储存时间不超过30天。
为了更好的储存,开启的试剂必须使用相对应的盖子盖上,盖子的颜色与试剂瓶的标签相对应。
这可以避免试剂之间的交叉污染。
3.注意:
在试剂盒开启后,稀释缓冲液不属于试剂盒的一部分,应当在室温下储存,且保存时间不能超过30天。
4.避免试剂保存温度超过35度,也不要冰冻。
5.在使用前,试剂需要平衡至室温(15-30度)。
6.目视检查试剂盒包装,并确定试剂在正确的位置。
通过匹配其特有的彩色瓶帽颜色和相应标签,检验每种试剂是否在适当的位置。
请参照以下图片的安置。
如果发现试剂放错了位置,或者存在重复的瓶子,不要使用该试剂盒,并通知客户技术服务进行更换。
7.试剂需避光保存。
8.试剂在正确的保存条件下是稳定的,直到保存到印刷在试剂容器或试剂盒上的失效日期。
不要使用过期试剂。
9.试剂盒组分经过大量的产生和测试。
不同试剂盒之间的试剂不能混合使用。
检测过程
样本收集和预处理
使用CellSave保护管收集全血
1.初始样样本应在开始治疗方案前进行设计。
后续样本可以在治疗方案开始后进行,在治疗过程中,通常在3至4周的时间间隔内检测CTC水平。
如果患者用阿霉素进行治疗,至少应在用药7天后才能取血检测。
2.只能使用CellSave保存管,通过静脉无菌的采集全血。
3.采血应直到血流停止,以确保血液样本与抗凝剂和保护剂的正确比率。
立即轻柔的倒转采血管8次进行混匀。
采血管反转防止凝血。
采血管颠倒不足或延迟,可能会导致不准确的测试结果。
4.血液样本可被存储在CellSave保护管中并进行输送。
请参阅CellSave保护管使用说明书。
不要冻存样本。
警告:
在使用CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统检测之前,目视检查每个样本是否凝血。
凝血的样本应被丢弃。
CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统检测过程
1.手动翻转5次保存样本血液的CellSave保护管。
然后拔出橡胶塞。
2.使用一支新的移液管从CellSave保护管中转移7.5ml血液到CELLSEARCH?
试剂盒提供的一个相应标记的15mlCELLSEARCH?
锥形管中。
3.再用一支新的移液管加入6.5ml稀释缓冲溶液到上述锥形管中。
4.盖上管盖,颠倒5次混匀。
5.样本离心,使用水平离心机800Xg离心10min。
该10min离心时间不包括达到800×g所需要的时间。
将离心机刹车“关闭”或者,如果你的离心机提供可变制动功能,设置制动到最低刹车设置。
使用能够在室温下离心的离心机在室温条件下离心。
样本离心后,目视检查每个样品管中血浆和红血细胞是否分离。
6.运行CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统之前,上述样本需要1h的准备时间。
请参阅CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统用户指南的完整说明。
使用CELLTRACKS分析仪II?
orCellSpotter?
分析仪分析样本
CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统使用CELLTRACKS分析仪II?
或CellSpotter?
分析仪将处理好的样本分配放入到暗盒中准备进行分析。
MAGNEST?
装置内的放有样本的暗盒应在黑暗中至少孵育20分钟,并在24小时内进行分析。
请参阅CELLTRACKS分析仪II?
或CellSpotter?
分析仪用户指南的样本分析和数据审查说明。
质量控制
CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞质控试剂盒(目录#7900003)检查整个系统的性能,包括仪器,试剂和操作。
在病人测试的每一天或使用大量新的CELLSEARCH?
试剂盒时,CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞质控应该进行。
请参阅CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞质控试剂盒使用说明书和预期值。
结果解释
结果以7.5ml血液中CTC的个数报告。
转移性的乳腺癌(MBC)
在治疗过程中的任何时期,7.5ml血液中CTC数量≥5,表示预后差。
预示着短的无进展生存期和总体生存期。
转移性的结直肠癌(MCRC)
在治疗过程中的任何时期,7.5ml血液中CTC数量≥3,表示预后差。
预示着短的无进展生存期和总体生存期。
转移性的前列癌(MPC)
在治疗过程中的任何时期,7.5ml血液中CTC数量≥5,表示预后差。
预示着短的无进展生存期和总体生存期。
注意
如果每7.5ml的样本血液中,有500个或更多的CTC数量,样品残留可能影响CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统对随后样本包括后续批次的分析。
如果细胞被延续到后续样本中,这些样本的CTC数量可能错误地比病人的实际的CTC计数更高。
请参阅CELLTRACKS?
AUTOPREP?
用户指南以获取更多信息。
局限
●CELLSEARCH?
结果应按照合适的病人管理程序与来自于诊断测试(即影像学,实验室检查)、体检和完整病史等所有的临床信息结合使用。
●本预后研究并没有证明任何当前治疗效果要比任何其他治疗或不治疗效果要好或者是差。
●CELLSEARCH?
计数结果和成像效果与评估无进展期到有进展期的转变不对等。
●如果患者使用阿霉素治疗,至少应在用药7天后才能取血检测。
如果用阿霉素治疗7天内取血检测,对CELLSEARCH?
检测结果的解释应谨慎。
●CELLSEARCH?
不能检测不表达EpCAM的CTC。
●CELLSEARCH?
不能检测表达EpCAM,但不表达细胞角蛋白8、18和19的CTC。
●干扰物质:
用未处理的样本作为对照,将SK-BR-3细胞掺入到血液样品中,并同潜在的干扰物质进行作用。
对以下癌症药物的毒性水平(5次治疗指数),包括非处方药和其它外源物质进行了测试:
环磷酰胺,丝裂霉素C?
,普罗克瑞?
,生物素,5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,他莫昔芬柠檬酸盐,紫杉醇,阿那曲唑?
,对乙酰氨基酚,乙酰水杨酸,咖啡因,右美沙芬,阿可达?
,人抗小鼠抗体(HAMA)1型,HAMA2型,赫赛汀,和布洛芬。
检测到SK-BR-3细胞数无显着差异,这表明这些物质不与CELLSEARCH?
试剂盒产生干扰。
通过对加入阿霉素毒性水平的测试,发现阿霉素能导致白细胞同时被异常染色成细胞角蛋白和CD45双阳性细胞,这是由于阿霉素能作为荧光化合物嵌入到细胞核中。
如果这样,所有的细胞都是CD45阳性和细胞角蛋白阳性染色,作为一个已知的干扰物质染色,这种结果容易观察,操作者也很容易识别。
如果血液在阿霉素用药7天后的清除期检测,这种干扰是不可能在给定的控制治疗水平和快速的药物清除临床实践中观察到。
血脂潜在的干扰也被研究,将浓度为2.6%英脱利匹特加入到样品中,其对应于大于1000mg/dl的甘油三酯。
将样品溶解到模拟的总溶血。
7.4mg/dl的胆红素,HAMA1/HAMA2和18-60%的血细胞比容也进行了研究。
脂血,溶血,黄疸和广泛的血细胞比容值均不干扰CELLSEARCH?
测试。
HAMA1和HAMA2也不会干扰,这表明通过非肠胃途径接收小鼠Ig的个体可以用CELLSEARCH?
进行成功测试。
预期值
健康志愿者,非恶性乳腺疾病者,其他非恶性疾病者
对145名健康志愿者,101名非恶性乳腺疾病妇女,和99名其他非恶性疾病妇女作为对照组进行单点CTC分析发现:
健康个体的外周血中均不存在上皮细胞。
在包括345个总样本的健康志愿者和非恶性疾病妇女中,只有一个例CTC超过5个/7.5ml。
结果列于表1中。
表1.对照组
健康志愿者,非恶性结直肠疾病者
从35岁以上(包括35岁)的健康男性和女性采取血液。
这些健康志愿者均来自于美国的三个中心。
本研究的目的为:
从每个受试者取2管血,并都进行CTC水平的测定评估。
总共有150个可评价受试者的血液进行了一个或两个单独的7.5ml血液CTC的测定。
并非所有评估的受试者都有两管CTC的结果。
两组受试者的循环肿瘤细胞平均数是0.0,标准偏差为0.1?
0.2。
从健康志愿者(男性和女性)的284个总样本中,没有一个受试者CTC数超过3个/7.5ml。
结果示于表2中。
表2.Cellsearch?
分析对照样本中CTC结果
健康对照
所有对照
男性
女性
Tube1
Tube2
Total
Tube1
Tube2
Total
Tube1
Tube2
Total
数量
149
135
284
68
64
132
81
71
152
CTC范围
0-1
0-1
0-1
0-1
0-1
0-1
0-1
0-1
0-1
CTC均值
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
CTC标准差
0.1
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
N(%)_>1CTC
2(1%)
4(3%)
6(2%)
1(1%)
1(2%)
2(2%)
1(1%)
3(4%)
4(3%)
N(%)_>2CTC
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
从接受结肠镜检查或手术为良性疾病的患者中采集大约30ml的血液(以增加检测细胞的概率)到4个独立的CellSave管中(每管至少7.5ml)。
依照之前的检测方法,对每个受试者总共进行了4次7.5ml血液中CTC数量的检测。
其结果示下面的表3中。
并非所有评估的受试者都有4次检测的CTC结果。
没有1例良性结肠疾病病人在每7.5ml血液只有超过1个CTC的检出。
表3.Cellsearch?
分析良性结直肠疾病样本中CTC结果
图1显示了健康人(对照)、良性疾病患者(对照)、在治疗开始前和开始治疗大约1个月后的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性前列腺癌患者中CTC的频率。
图1.对照组(非癌症样本)、转移性乳腺癌(MBC)、转移性结直肠癌(MCRC)、转移性前列腺癌患者(MPC)在治疗前和治疗后2-5周CTC检出数量
1MBC转移性乳腺癌相关数据信息见临床IFU的表1.
2MCRC转移性结直肠癌相关数据信息见临床IFU的表12.
3MPC转移性前列腺癌相关数据信息见临床IFU的表22.
性能指标
回收率
采取单个健康受试者血液6管,每管7.5ml。
其中5管分别加入数量为1300,325,81,20,和5的培养乳腺癌细胞(SK-BR-3)。
第6管不加SK-BR-3细胞作为零点。
这些样本用CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞试剂盒在CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统上运行并用CELLTRACKS分析仪II?
对CTC进行计数。
共对5名健康志愿者进行重复实验。
并用所检测到的细胞数对理论细胞数作图。
该结果总结于表4中。
表4回收率
以确定整体,或最小二乘拟合,对于跨所有数据所检测到的和预期的细胞数的比较中,进行线性回归分析。
这30个样本的回归方程为Y=0.93x+3.87(R2=0.999R=0.999)。
这项研究结果表明,在测试的CTC范围内,根据回归分析,其回收率平均为93%。
肿瘤细胞数的线性关系,期望的检测值与预期曲线的斜率应为1.0。
但是,实验所得斜率为0.93。
这是因为与CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞检测试剂盒配套使用的CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统涉及到捕获和荧光标记细胞,并使用CELLTRACKS分析仪II?
进行随后的检测和计数。
这个过程会造成细胞损失。
细胞损失可以归因于以下可能性之一:
1)通过CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统,只有93%的回收肿瘤细胞投入到了7.5ml血液中,
2)只有93%的肿瘤细胞通过CELLTRACKS分析仪II?
进入到样品室中,或
3)两者的这些误差源的组合。
线性/报告范围
?
检查之前数据可靠性的另一种方式是将待分析样本作系列稀释,以评估测试的线性度。
我们通过使用稀释系列的初始样品的检测值(即,第1管)的稀释系数划分确定用于稀释系列的每个患者样本的预期值除去回收百分比的混淆变量。
对所有检测到的肿瘤细胞与预期肿瘤细胞的数目回归分析产生了1.007的斜率,截距为3.0,R2=0.990(R=0.995)。
因此,自从回收率(细胞丢失)受每个初始样品的CTC值影响时,数据分析表明,CTC的检测线性范围为0至1238个肿瘤细胞。
检测下限
CELLTRACKS分析仪II?
可检测到每7.5ml血液中仅1个CTC,即暗盒中CTC的检测下限为1个CTC。
线性回归分析显示,平均而言,使用CELLTRACKS?
AUTOPREP?
系统能回收7.5ml血液样本中93%的CTC(见回收率部分)。
样本中大约7%的CTC损失不足以影响1个CTC的检测下限。
重复性
a.CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞质控品系统重复性
制备了三个独立的CELLSEARCH?
循环肿瘤细胞的质控样品,每天进行分析处理,总共超过30天,参照NCCLS指南EP5-A2的长期运行方式。
每单次使用的样本瓶含有低、高两个浓度的细胞系。
这两个细胞系已经固定,并用两种不同的荧光染进行预先染色。
高低浓度的质控细胞统计数据展示如下表5。
表5.精密度分析统计结果
b.病人样本系统重复性
转移性乳腺癌(MBC)
在临床研究的过程中,共收集47例转移性乳腺癌患者的163份重复血液样本。
这些样品在多点进行处理,以测定CTC方法的重复性。
对这163份重复样品进行对比的回归方程为Y=0.98x+0.67,R2=0.99。
图2示出了MBC患者血液的重复样本CTC结果在对数刻度上绘制的散点图,阈值为5个CTC,由虚线标出。
图2.在转移性乳腺癌(MBC)样本中CTC计数,样本数163例,每7.5ml血液中CTC均值小于5或者大于5
图2备注:
可能有一个以上的点叠加在另一个点上。
例如,在这个图中,有50例(31%)的两个管有0CTC,18例(11%)的第1管有0CTC和第2管有1CTC,另有18例(11%)的第1管有1CTC和第2管有0CTC。
转移性结直肠癌(MCRC)
在临床研究的过程中,共收集430例转移性乳腺癌患者的1627份重复血液样本。
这些样品在多点进行处理,以测定CTC方法的重复性。
对这1627份重复样品进行对比的回归方程为Y=0.98x+0.18,R2=0.96。
图3示出了MCRC患者血液的重复样本CTC结果在对数刻度上绘制的散点图,阈值为3个CTC,由虚线标出。
图3.在转移性结直肠癌(MCRC)样本中CTC计数,样本数1627例,每7.5ml血液中CTC均值小于3或者大于3
图3备注:
可能有一个以上的点叠加在另一个点上。
例如,在这个图中,有975例(60%)的两个管有0CTC,116例(7%)的第1管有0CTC和第2管有1CTC,另有109例(7%)的第1管有1CTC和第2管有0CTC。
来自转移性乳腺癌和结直肠癌患者的血液样本中,管与管之间CTC的变异计数显示于图2及3,偶发事件(如肿瘤细胞)的一个给定体积内的分布是随机的和独立的细胞或疾病类型。
这个最好的特征是泊松分布-用于建模系统的数学方法,其中发生的事件的概率非常低,但机会对于这样一个事件的发生数是较大的5。
对于极少管的前列腺CTC,它合理的期望变化结果类似于在图2和3中所示。
因为在MBC和MCRC患者以前的研究显示了几乎相同的结果,转移性前列腺癌患者血液样本CTC计数管与管之间的比较,在CELLSEARCH?
CTC前列腺临床试验过程中没有实施。
但是,在MemorialSloan-Kettering癌症中心使用CELLSEARCH?
技术的一项独立研究的结果显示,转移性前列腺癌患者每管CTC数量在0到1192个的范围内,CTC计数在点到点或管与管之间没有系统性的变化4。
参考文献
1.CancerBiology,3rdedition,RayRuddon1995.
2.NCCLSApprovedGuidelineEP5-A,“EvaluationofPrecisionPerformanceofClinicalChemistryDevices”.
3.NCCLSApprovedGuidelineC28-A2,“HowtoDefineandDetermineReferenceIntervalsintheClinicalLaboratory”.
4.ShafferDR,LevershaMA,DanilaDC,LinO,Gonzalez-EspinozaR,GuB,AnandA,SmithK,Maslak,P,DoyleGV,TerstappenLWMM,LiljaH,HellerG,
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