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聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法
聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法
摘要近年来,聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一,得到越来越广泛的应用。
鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性,如何使它更好的修饰蛋白并对修饰后产物进行分析鉴定是研究的重点与难点。
本文主要就PEG定点修饰的技术和PEG化蛋白的成分、结构分析方法及各种方法的优缺点作一介绍,并展望了未来的发展趋势。
AbstractPolyethyleneGlycol(PEG)modificationtechnologyhasbecomeoneofthemosteffectivetechnologiesinproteindrugs,gettingmoreandmorewidelyusedinrecentyears.Inviewofthecharacteristicsofpolyethyleneglycolitselfandthemultiplestructureofproteins,it’snecessaryanddifficulttoachievebettermodificationandanalysetheModifiedproducts.Inthispaper,wefixedonthePEG-modified-proteintechnologyandcomponents,structuralanalysismethodsandtheadvantagesanddisadvantagesofvariousmethodstomakeapresentationandprospectthefuturetrendofdevelopment.
关键词:
蛋白类药物,聚乙二醇化,修饰位点,结构分析方法
Keywords:
Proteindrugs,Peginterferon,modificationsites,structureanalysismethods.
正文
药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。
药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。
第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<20000)。
常用的修饰剂有单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SC)等,通过酯键或三嗪环将聚乙二醇与药物分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个药物分子经常连接数个聚乙二醇分子【1】。
但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。
以应用相对分子质量高(>20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。
但总得说来,蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。
根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。
1修饰氨基
多肽蛋白质分子参与PEG化反应的基团常为α-和ε-氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)种类较多,可分为烷基化mPEGs和酰基化mPEGs两大类。
烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。
其中mPEG-醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低pH下仅修饰N-末端氨基,对活性影响较小,同时方便产物的纯化和鉴定,已用于G-CSF、IFN及CD4-IgG等的修饰【2】。
mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和,对GM-CSF修饰后使其保持较好活性。
mPEG-环氧化物虽制备简单,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反应,修饰率也较低。
酰基化mPEGs,包括mPEG-琥珀酰亚胺酯和mPEG-苯并三唑碳酸酯,这两种修饰剂可优先与赖氨酸残基反应,也可与组氨酸和酪氨酸残基反应。
此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及mPEG-氧羰基咪唑比前述两种反应活性低,但修饰专一性较好。
2基于氨基保护的定点修饰
对于蛋白中含有多个修饰位点,可以利用氨基保护试剂对修饰后会导致蛋白失活严重的位点实施保护,对活性高的修饰位点进行定点修饰后,再将保护试剂去除。
Youn等【3】研究发现生长激素释放因子(GRF)由于蛋白水解和肾小球过滤作用,其在体内的半衰期非常短,无法有效发挥药效,因此选择PEG修饰技术解决这些问题。
但是在该蛋白序列上,有3个修饰位点(Try1,Lys12和Lys21),其中修饰第21位赖氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性,因此,将1位Try和12位Lys的氨基进行92芴甲氧羰基(FMOC)修饰保护后,用活化mPEG修饰21位Lys获得定点修饰蛋白,然后再将FMOC去除。
这样既能保持生物活性,又能获得半衰期长,稳定的蛋白药物。
。
3修饰羧基
有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。
一般选用mPEG-酰肼或mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。
mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。
4修饰巯基
与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。
对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。
这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性【4】。
目前可用于巯基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等。
其中mPEG-马来酰亚胺制备简单,应用较多。
PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的S—S键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。
PEG-乙烯基砜在pH7-9范围内可选择性的与巯基反应,当pH较高时则与氨基交联。
PEG-碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。
5二硫键定点修饰
对蛋白中含有的二硫键进行PEG定点修饰分为2个步骤:
首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基;第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成PEG的定点修饰。
在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG选择性的修饰两个硫基,PEG的立体屏障作用确保1个二硫键只结合1分子PEG。
但是二硫键PEG修饰可能会由于PEG的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性。
Veronese等【5】利用变性剂盐酸胍(3mol/L)使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成PEG修饰后,通过透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性。
6非极性氨基酸定点修饰
通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰。
Deiters等开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的PEG-酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体,从而完成对蛋白的定点修饰。
另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定PEG修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。
Cazalis【7】通过基因工程方法在血栓调节蛋白(Thrombomodulin)的C端引入叠氮蛋氨酸,与mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修饰剂生成稳定的单修饰物,尽管该方法比较复杂,但至少给我们提供了一个新的PEG修饰蛋白的思路。
7糖蛋白中糖基定点修饰
此类PEG定点修饰的原理是:
首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸钠氧化糖类残基产生具有反应活性的醛基,这些醛基可与mPEG2肼衍生物反应生成腙或与mPEG2胺衍生物反应生成可逆的Schiff碱。
用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而Schiff碱可以还原为仲胺。
相对于mPEG-胺衍生物修饰,PEG-肼衍生物修饰不会形成交联聚合体,更适合于糖基的修饰,最有代表性的mPEG2肼衍生物是mPEG2酰肼(hydrazide2mPEG)。
酰肼基团极低的pKa值使得酰肼基团在酸性环境下(pH4.5~5.0)中仍可以和羧基结合,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰。
由于蛋白种类多样和结构复杂,往往会使得PEG修饰反应特异性不强,反应条件要通过大量试验优化。
如果能够利用计算机技术对蛋白质晶体结构表面性质进行理论计算和分析,确定可能的反应位点和基团,并根据被修饰基团与修饰剂的结构特点设计合适的连接物,这样不但可以减少PEG修饰的盲目性,而且能够提高研究效率。
胡远东等【8】利用InsightⅡ分子模拟软件包(BiosymInc.,SanDiego,CA)对牛血红蛋白晶体(bHb)进行了结构分析和分子模拟,计算了蛋白表面24个可进行PEG修饰的Lys残基及其主要原子的溶剂可及表面积,确定了其中可以进行修饰的13个Lys残基(溶剂可及表面积>0.4nm2),并进一步设计了具有双功能基团的小分子化合物环氧乙烷基活化PEG作为连接体。
结果表明,PEG修饰的bHb的携氧能力和免疫原性等生物学指标均达到预期结果。
聚乙二醇修饰的鉴定与检测
PEG分子存在一定的相对分子质量分布,因此,PEG修饰的多肽蛋白质无精确理论相对分子质量。
此外,蛋白质表面可修饰的氨基位点较多难于实现定点修饰,从而使PEG修饰的空间结构进一步复杂化。
总之,蛋白质与聚乙二醇反应后的产物是混合物,即使是相同修饰度的蛋白质分子之间也会因修饰位点的不同而呈现多态性。
这种多态性给聚乙二醇修饰的多肽蛋白质的分析带来较大困难。
PEG化蛋白质的检测与分析至少应该有三个方面
(1)蛋白的平均修饰度
(2)PEG修饰的位点及特定位点被修饰程度(3)不同修饰度的蛋白质的相对含量其中PEG修饰的特定位点及特定位点被修饰程度的检测目前研究的还比较少,不成熟。
现将几种常用的检测分析方法介绍如下:
1分光光度法和荧光胺法来检测聚乙二醇修饰程度
自从1960年Satake等介绍用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋白质氨基浓度以来,该方法已成为测蛋白质修饰度最常用的方法。
TNBS与蛋白质反应,蛋白质的赖氨酸残基的氨基末端进攻TNBS的磺酸基,并将其取代,形成的复合物有特定的光吸收,以此测定其含量。
该方法简单易行,但该方法存在如下缺陷:
(1)TNBS与蛋白质反应受pH影响较大所以实验前应先测定最佳pH;
(2)对于较小的蛋白质该方法精确度不高。
Stock等采用荧光胺法测定修饰度。
荧光胺与蛋白质赖氨酸残基的氨基末端发生反应生成的产物有特定的光吸收,通过测定蛋白质混合物所激发的荧光值来测定其平均修饰度。
巯基的测定也可采用DTNB分析法。
该方法灵敏性很高,仅需纳克级的蛋白质就能完成。
比如国内有人采用TNBS法和荧光胺法来测定聚乙二醇化天花粉蛋白(PEG-TCS)的修饰度【9】。
[图1:
TNBS法测定PEG-TCS修饰度所绘制的标准曲线,PEG修饰率%=1-(修饰蛋白的斜率/未修饰蛋白的斜率)*100%]
[图2:
荧光胺法测定PEG-TCS修饰度所绘制的标准曲线]
此外,较为精确的方法是用一端连有正亮氨酸(norleucine)或荧光素(fluorescein)的PEG分子修饰蛋白质,通过测定这些标记物的含量来计算蛋白质偶联的PEG个数,但这类方法所用的PEG衍生物较昂贵,不适于常规分析。
色谱法
如果用色谱法可以将聚乙二醇反应后的混合物逐一分离,则可以绘制随浓度变化的工作曲线,根据工作曲线来为各个组分定性及定量从而确定混合物的平均分子量和平均修饰度。
Snider等分别利用高效离子交换色谱高效体积排阻色谱、高效反相液相色谱等对PEG-SOD作分析,结果显示其分辨率很低,不能将各种分子逐一分析,谱带宽且杂乱。
Mcgoff用体积排阻色谱对PEG化的SOD进行分析,SOD为一尖锐的峰。
而PEG化的SOD则为一宽峰而且不能分离完全。
但对于修饰位点少的蛋白质或多肽而言色谱法效果较好。
如BrianFenton等用RP-HPLC对PEG-Hirudin(水蛭素)分析由于水蛭素只有三个修饰位点其产物较少可以很清楚的看出有三个峰分别为PEG-Hirudin(PEG),2-Hirudin(PEG),3-Hirudin【10】。
同样,军事医学科学院的研究人员利用单甲基化的PEG-丙酸琥珀酰亚胺(mPEG-SPA)对水蛭素(hirudin,HV)进行化学修饰,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对水蛭素的PEG修饰产物进行分析分离【11】。
mPEG-SPA和水蛭素摩尔比为分别为0.5∶1和1∶1的前提下,反应产物的各组分均能实现基线分离,说明其适用范围较宽,能够保证在修饰反应条件发生变动时对产物中各组分的有效分析分离。
(下图是mPEG-SPA和水蛭素摩尔比为1∶1的反应产物的RP-HPLC谱图;A和B分别为不同批次样品)
凝胶渗透色谱(GPC)属于凝胶色谱的一种,凝胶色谱以多孔性填料为固相填料上有许多大小不一的孔径据样品的尺寸大小实现分离以有机溶剂(如甲苯四氢呋喃等)为流动相的称为凝胶渗透色谱,以水溶液为流动相的称为凝胶过滤色谱,有机相能很好的溶解大分子PEGBullok等用碱水解使蛋白质与PEG分离再对水解下来的PEG进行凝胶渗透层析通过测定PEG的量以测修饰度【12】。
但该方法可能因为水解不彻底和样品中含有游离的PEG而受干扰
SDS-PAGE凝胶电泳法
凝胶电泳是蛋白质分析中十分常用的方法,其分辨率高且可以测定分子量,但该法在测定PEG化蛋白质的分子量方面却存在很多缺陷。
由于PEG在蛋白质表面的屏蔽作用和PEG分子与凝胶分子的缠绕作用使PEG化的蛋白质在凝胶中的迁移速度减慢,测出的分子量偏大。
Kurfurst用常规的电泳法测定PEG修饰后的水蛭素分子量,结果比理论值大一倍以上。
用碘化钡将PEG染色,根据PEG标准曲线测定分子量,其值要准确的多。
Kurfurst还用等电聚焦法分析PEG修饰后的水蛭素,也证明有三种物质:
Hirudin,PEG-Hirudin,(PEG)2-Hirudin。
另外,用毛细管区带电泳对PEG化蛋白质的分析也屡见报道。
由于蛋白质的疏水作用、静电作用和其它多种两相分配机制,毛细管中的蛋白质容易吸附在管壁上,尤其是碱性蛋白质的静电吸附最为突出,这样使毛细管电泳的分离效率下降,峰高降低甚至不出峰。
为克服蛋白吸附,常采用化学方法来消除或覆盖管壁上的硅羟基,使石英表面转化成高分子涂层。
Cunico等通过改性剂使毛细管柱内壁带正电荷,电渗流从通常的正极到负极方向变为负极到正极方向,减少了蛋白在毛细管内壁的吸附,同时也提高了分离度【13】。
其它方法
红外光谱也是鉴别化合物、确定分子结构常用的手段之一,对单一组分或混合物中各组分也可以进行定量分析,由于拉曼散射光的频率位移对应于分子的能级跃迁。
Bullock[14]等报道,红外光谱测定相对而言较为快速直接,不需要对样品进行预处理,可以根据C-O-C键的吸收强度给聚乙二醇定量,但必须假设连接了SOD和没有连接SOD的聚乙二醇的C-O-C键的吸收强度相同。
另外,由于红外光谱对PEG-SOD中的PEG没有特征吸收,所以游离PEG的量需要用GPC法检测并扣除。
而且,该方法确定修饰度还需要知道精确的蛋白质含量,这也可能成为误差来源。
还可以采用核磁共振(NMR)测定C14标记的PEG修饰蛋白的平均修饰度[15]。
Banci等用NMR测定了钴盐取代的聚乙二醇修饰铜钴超氧化物岐化酶的H1质子谱图,发现该酶活性位点的空间结构没有受到修饰反应的破坏。
另外,光散射法,双水相萃取分离分析法等也被用于分析,不再一一赘述。
聚乙二醇化位点的鉴定
蛋白质类药物PEG化位点鉴定的一般方法是以天然蛋白质作对照,用蛋白酶(如胰蛋白酶)水解,由缺失的肽片段来推断PEG化位点。
但该方法存在一定缺陷,易出现鉴定误差。
VeroneseFM等采用一种新的PEG衍生物,可解决鉴定差的问题,即用经琥珀酰亚胺酯活化的氨基酸(Met-Nle或Met-β-Ala)作为连接键,偶联物经BrCN裂解可得到与Nle或β-Ala相连的蛋白质经常规分析(如氨基酸分析、Edman降解法)可以确定Nle或β-Ala连接位点,进而确定PEG化位点。
质谱法
质谱法是测定物质结构的重要手段。
VestlingMM等【16】对PEG修饰后的超氧化物歧化酶(SOD)进行水解,采用串联质谱(tandeMS)测定其肽图,以判断修饰位点及修饰程度。
近年来,一种新型的质谱方法-基体辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)被成功地用于PEG修饰蛋白组分的定性与定量分析。
MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程。
TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。
该质谱最大特点是可以分析高分子量的生物大分子,被测分子量可达50万道尔顿。
ChulYoo【17】等利用基于MALDIMS的多种技术来鉴定分析一种的含31个残基并且其赖氨酸的支链被20kDa线性PEG修饰的多肽(预期设计)。
序列为:
Ac-WVTHR*LAGLLSR*SGGVVK*K19NFVPTDVGPXAF-NH2,R*为瓜氨酸、K*为高精氨酸、X为萘-丙氨酸。
上图是放大的reISD(反射式源衰变)光谱,具有3490.87Da的[M+H]+峰,同时可观察到大量的c-,y-,[z+2]型的碎片信号。
利用ISD(源衰变)序列分析和高精氨酸可以测得完整的序列范围,未被修饰的19-赖氨酸残基也可通过此光谱准确无误的鉴定。
其它的利用MALDI-MS的断裂技术,如CID(collision-induceddissociation)或源后衰变(PSD),除了常见的b-和y-系的碎片离子外,还会导致过度退化的a-,d-,v,和w-系的碎片产物。
当遇到更高的分子量时,由于不稳定的肽键大多被离解CID读出的数据并不可靠。
而ISD能够均匀的穿过序列,产生相对简单的碎片离子图谱,主要是c-,(z+2)系的碎片离子,它们是由肽链骨架的N-Cα键断链形成的。
然而,基于ISD的MALDI-TOFMS其实是一种“假MS/MS”技术,具有与前体离子选择不相符的内源碎片。
这要求样品要高度纯净或者ISD-MALDIMS连有离线色谱分离(装置)。
上图是将上述质子化的PEG化多肽的所获得的ISD光谱。
所有的碎片离子都以质子化的形式呈现,有c-和y-系。
如同质子化的单体多肽那样,它们显示出清晰的裂解谱。
但是,PEG化多肽的离子系分别在19-赖氨酸,c18和y12处被截断。
这种特定的截断作用,可以有力的指示修饰发生在19-赖氨酸处,即这就是PEG化的位点。
此处,PEG部分由于分子量过大(20KD)不能被reISD光谱监测。
基于其极高的精度和reISD产生的范围从10000到20000的碎片峰,这一技术以足够用以探测,定位和指示修饰作用引发的分子质量微小的改变。
此实验中,PEG作为一个大的杂分子与19-赖氨酸连接,使此处的质谱测序信息丢失。
蛋白质被修饰的侧链所产生的碎片,如磷酸盐,聚糖或二硫键是不能通过ISD,ECD,ETD光谱观察到的,离子系在19-赖氨酸处的截断与预测相符。
这与二硫键鉴定和吡咯氨酸的情况类似。
同样的由于环状部分的存在,序列测定时会丢失此处的信息。
实验用到的模型相对简单,适合于直接的分析。
它基本上只含有单一潜在的PEG化位点,其N-末端被乙酰化,并且对常用的PEG化化学试剂不敏感。
然而,当对象复杂性较高,就需要进一步的研究来保证这种方法能够辨别不同的PEG化位点和定量各自的修饰度。
可见,MALDI-TOF-MS具备了足够高的分辨率,能够鉴别出这种混合态PEG化多肽中的每一种寡聚物成分。
而经典的ESI-MS光谱则显得非常复杂且不能鉴定这一分子。
利用MALDI-TOFMS进行反射源衰变(reISD)分析是为了在样品未经任何处理,分子完好无损的情况下来鉴定聚乙二醇化的位点。
自从20世纪70年代以来,已有十余种PEG修饰的蛋白药物上市,,表现出优良的临床效果,还有PEG-水蛭素等多种药物正处于临床实验阶段针。
但仍有许多蛋白药物由于常规的多点修饰不能得到理想的效果,因此随着PEG修饰蛋白技术研究的不断深入,已从原来的多点随机修饰向定点单修饰发展,由复杂的多单元操作向便捷高效的集成操作发展,提高了修饰蛋白的生物活性,降低了PEG修饰的成本,扩大了PEG修饰技术的应用范围。
鉴于蛋白质类药物本省的理化特性,只有根据其不同性质综合考虑,选择合适的PEG修饰技术才能起到良好的效果。
对不同的酶多肽或蛋白选择适宜的PEG活化和偶联方式以及相应的产物分离与结构分析检测的各种方法都有其适用范围和局限性至今还没有通用的方法可供选择[18]。
对被修饰蛋白的修饰度及结构的测定仍是该类产品开发的核心与难点。
随着PEG修饰技术和分析技术的研究的不断深入,先进仪器的出现以及不同检测方法的联合运用必将进一步提高聚乙二醇修饰蛋白质的特异性从而使产物的分离纯化和分析检测更加简单易行,这也是PEG修饰技术发展的必然要求。
参考文献
[1]张修建,王清明,陈惠鹏.药物的聚乙二醇修饰研究进展.解放军药学学报[J].2003,19(3):
213-216.
[2]秦海娜,修志龙.聚乙二醇修饰蛋白质的活化与检测方法.化学通报[J].2003,66:
1-10
[3]YounYS,LeeKC.Site2specificPEGylationforhigh2yieldpreparation
ofLys(21)-aminePEGylatedgrowthhormone-releasingfactor(GRF)
(1-29)usingaGRF(1-29)derivativeFMOC-protectedatTyr
(1)and
Lys(12).BioconjugChem[J],2007,18
(2):
500-506.
[4]YuP,ZhengC,ChenJ,etal.InvestigationonPEGylationstrategyofrecombinanthumaninterleukin-1receptorantagonist.BioorgMed
Chem[J],2007,15(16):
5396-5405.
[5]WGXing,ZWDong.DiscardedfreePEG-basedassayforobtainingthemodificationextentofpegylatedproteins.Talanta[J].2007,71:
381-384.
[6]StefanoSalmaso,AlessandraSemenzato,etal.Site-selectiveproteinglycation
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