国家或地方技术规范:甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法.docx
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ICS65.020.20
CCSB16
33
浙江省地方标准
DB33/T2408—2021
甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofDickeyadadantii
2021-12-24发布
2022-01-24实施
浙江省市场监督管理局发布
DB33/T2408—2021
前言
本标准按GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:
标准化文件的结构和起草规则》的要求起草。
请注意本标准的某些内容可能涉及专利。
本标准的发布机构不承担识别专利的责任。
本标准由浙江省农业农村厅提出。
本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:
浙江省植保检疫与农药管理总站、浙江大学、浙江省植物保护学会。
本标准主要起草人:
楼兵干、李艳敏、沈肖玲、陆剑飞、施海萍、高其康、李国钧、张莉丽、李月红、刘丽华、仇智灵、姚海峰、王荣洲。
I
DB33/T2408—2021
甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了术语与定义、缩略语、甘薯茎腐病菌PCR反应和实时荧光PCR反应体系的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。
本标准适用于甘薯根、茎、叶等植物材料甘薯茎腐病菌的检测。
2规范性引用文件
本标准没有规范性引用文件。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
甘薯茎腐病菌thepathogenofstemandrootrotofsweetpotato
引起甘薯茎腐病的病原菌,属于细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、伽玛变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacterales)、果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌属(Dickeya)、达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。
革兰氏阴性细菌,菌体短杆状,大小约为2.36μm×0.40μm,周生鞭毛,可在烟草上激发过敏性反应(HR)。
注:
症状特征见附录A。
4缩略语
下列缩略语适用于本标准。
bp:
碱基对(Basepair)
CFU:
菌落形成单位(Colony-FormingUnit)
CTAB:
溴代十六烷基三甲胺(Cetyltrimethylammoniumbromide)
DNA:
脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)
dNTP:
脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)
HR:
过敏性反应(HypersensitiveReaction)
MALDI-TOFMS:
软电离高分辨飞行时间串联质谱仪(Matrixassistedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrometry)
NA:
营养琼脂(NutrientAgar)
NGM:
营养琼脂甘油培养基(NutrientAgarGlycerolMedia)
PCR:
聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)
RT-PCR:
逆转录-聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)Taq:
水生噬热杆菌(Thermusaquaticus)
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5方法原理
根据甘薯茎腐病的菌落形态特征、田间危害症状特征、分子生物学PCR或RT-PCR反应特征、蛋白质指纹图谱特征和致病性测试结果等进行检测鉴定。
6试剂或材料
6.175%乙醇。
6.21%次氯酸钠。
6.3蛋白胨。
6.4牛肉浸膏。
6.5氯化钠。
6.6琼脂粉。
6.7蔗糖。
6.8NA、NGM培养基配方,培养基配比按附录B执行。
6.9PCR凝胶电泳检测试剂,制备方法按附录C执行。
6.10实时荧光PCR检测试剂,制备方法按附录D执行。
7仪器设备
7.1普通冰箱。
7.2超低温冰箱:
最低可设定温度-80℃。
7.3台式小型离心机。
7.4低温高速离心机。
7.5PCR仪。
7.6实时荧光定量PCR仪。
7.7电泳仪。
7.8水平电泳槽。
7.9凝胶成像分析仪。
7.10微波炉。
7.11电子天平:
最小分度值为1mg。
7.12显微镜。
7.13恒温培养箱。
7.14超净工作台。
7.15灭菌锅。
7.16旋涡振荡器。
7.17移液器。
7.18MALDI质谱仪:
需具有细菌鉴定分析模块及含D.dadantii质谱数据的菌株数据库。
8甘薯茎腐病菌检测流程
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甘薯茎腐病菌检测流程图见图1。
样品的准备
有症状
PCR扩增RT-PCR扩增
琼脂糖电泳结果判定
阳性阴性
致病性试验(可选)
样本上分离病原菌
结果判定
RT-PCR
阳性阴性
结果判定
阳性阴性
PCR扩增
琼脂糖电泳
结果判定
阳阴性
或PCR
或MALDI-TOFⅡ
无症状或有症状(新发区)
致病性试验
图1甘薯茎腐病菌检测流程图
9症状观察
对于植株样品,参见附录A中的症状描述观察有无甘薯茎腐病典型症状,对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状的块根、藤蔓、叶柄、叶片等进行检测,无症状植株随机取样测试。
10实验室检测
10.1样品处理
10.1.1对于有症样品:
取病健交界处组织置于低倍显微镜下观察有无喷菌现象(见附录A)。
如观察到喷菌现象,剪取病健交界处3块~5块组织,每块约10mm×10mm,表面消毒后无菌水洗三次,剪碎后加入1mL生理盐水,室温浸泡15min~30min或4℃冰箱8h以上,取浸泡液12000r/min(离心力10000g)离心5min,1mL无菌水悬浮沉淀,用于PCR检测或直接平板划线进行病菌分离培养,28℃培养2d~3d,获得单菌落。
10.1.2对于无症样品:
取10块~20块植物材料剪碎,100mL~200mL生理盐水4℃冰箱过夜,浸泡液10000r/min(离心力9000g)离心20min,1mL无菌水悬浮沉淀;12000r/min(离心力10000g)离心5min,沉淀用于提取DNA和PCR检测;如PCR检测为阳性,将上述检测样品表面消毒,无菌水洗三次后,加入100mL生理盐水,室温浸泡1h或4℃冰箱8h以上,浸泡液10000r/min(9000g)离心20min,1mL无菌水悬浮沉淀,悬浮液稀释2个~3个梯度,于NGM或NA平板涂布3个~5个平板分
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离,28℃培养2d~3d。
10.1.3分离培养鉴定:
用灭菌接种环蘸取样品悬浮液在NGM或NA平板上划线分离,同时,将悬浮液进行10倍梯度稀释3次,各取100μL稀释液涂布培养皿,重复3次,28℃恒温培养2d,挑取疑似甘薯茎腐病菌单菌落进行转接纯化,菌落形态特征见附录A,再采用本标准10.2或10.3方法进一步鉴定。
NGM和NA培养基的配方按附录B执行。
10.2PCR检测
10.2.1模板制备
样品DNA的提取可按CTAB方法,也可使用商品化的DNA提取试剂盒提取。
提取的核酸用于PCR检测或-20℃保存备用。
10.2.2常规PCR检测
对于有症样品,以标准菌株做阳性对照,健康植物组织做阴性对照,双蒸水作为空白对照进行PCR检测,具体检测步骤和判定标准按附录C执行。
单菌落可制成菌悬液直接进行PCR检测。
10.2.3实时荧光PCR检测
检测步骤按附录D执行,对照设置按本标准10.2.2执行。
单菌落可制成菌悬液直接进行实时荧光PCR检测。
10.3MALDI-TOF质谱鉴定
单菌落按MALDI-TOFMS质谱进行检测,具体鉴定步骤和判定标准按附录E执行。
10.4致病性测试(可选)
挑取疑似甘薯茎腐病菌单菌落制成108CFU/mL菌悬液,用针刺接种方法对甘薯藤蔓进行致病性测试。
对照为无菌水接种,保湿1d,25℃~30℃,12h/12h生长。
接种2d~4d后观察接种位置附近是否出现症状。
根据柯赫氏法则,对发病处组织再分离病菌,分离单菌落进行PCR检测,完成验证。
11结果判定
对于有症状样品,PCR检测结果为阳性,即判定为检出甘薯茎腐病菌;无症状样品或新发生区的有症状样品,PCR检测结果阳性,且分离到病菌,参考致病性测试结果,判定检出甘薯茎腐病菌。
其中,PCR检测可根据实验条件,选择本标准10.2.2或10.2.3的一种进行检测,任意一种检测方法的结果为阳性则判定为PCR检测结果为阳性。
分离的疑似甘薯茎腐病菌单菌落鉴定可选用本标准10.2.2或10.2.3或10.3中的一种进行检测,任意一种检测方法的结果为阳性则判定结果为阳性,即分离的单菌落鉴定为甘薯茎腐病菌D.dadantii。
12样品及检测结果保存
12.1样品保存与处理
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DB33/T2408—2021
样品经登记和经手人签字后妥善保存。
对检出甘薯茎腐病的样品应妥善保存,以备复核。
该类样品保存期满后应经高压灭菌处理。
12.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为甘薯茎腐病菌的菌株,可采用甘油保存或冻干保存,对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。
12.3结果记录与资料保存
实验记录包括:
样本来源、采样时间、采样地点、品种、样本的具体症状特点、送样时间、送样人、送样人联系方式和联系地址、检测时间、地点、方法和鉴定者。
疑似症状等应及时拍照保存,PCR检测结果需有原始实验数据及相关结果图片。
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附录A
(资料性)
甘薯茎腐病菌基本信息
A.1症状
在甘薯苗期、生长期至贮藏期均可发生,可为害薯块、薯苗、藤蔓、叶柄和叶片。
植株早期发病,叶片萎蔫,茎部、叶柄出现暗褐色至黑褐色软腐,维管束黑褐色,叶脉有变黑坏死的现象发生,叶片上出现黑褐色斑,见图A.1。
早期发病全株枯死。
中后期发病,在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中吸取营养而使植株“假健康”,到收获时发现藤蔓基部腐烂变成纤维状,薯块变黑腐烂。
贮藏期薯块初发病斑一般以芽眼为中心圆形,稍凹陷,黑褐色,后逐渐扩大引起整薯腐烂,病部软化腐烂有臭味。
图A.1甘薯茎腐病症状
A.2病原菌形态及培养性状
病原菌是革兰氏阴性细菌,菌体短杆状,大小约为2.36μm×0.4μm,周生鞭毛,见图A.2。
可在烟草上激发过敏性反应(HR),见图A.3。
病原菌在NA平板上28℃培养2d后,菌落淡土黄色、不透明、边缘不整齐、表面凸起稍皱缩,直径2mm~3mm,见图A.4的左图。
在NGM平板上28℃培养2d后,菌落呈煎鸡蛋状,边缘不整齐,表面略凸起,产生靛蓝,直径2mm~3mm,见图A.4的右图。
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图A.2D.dadantii菌体形态图
LA-08-0
LA-07-0
LA-05-02
LA-04-0P
LA-03-03
图A.3烟草过敏性反应
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图A.4D.dadantii在培养基上的菌落形态
注:
左图:
NA培养基;右图:
NGM培养基。
A.3接种症状
分离物10°CFU/mL菌悬液针刺接种甘薯藤蔓进行致病性测试。
对照为无菌水接种,保湿1d,25℃~
30℃生长。
接种2d~4d后观察接种位置附近是否出现症状,见图A.5。
根据柯赫氏法则,对发病处组织再分离病菌,进行PCR检测。
图A.5甘薯藤蔓上的接种症状
注:
左图为对照,右图为分离物。
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附录B
(规范性)
培养基
B.1NA培养基(1L)
B.1.1蛋白胨10g。
B.1.2氯化钠5g。
B.1.3蔗糖5g。
B.1.4牛肉浸膏3g。
B.1.5琼脂粉15g。
B.1.6蒸馏水1000mL。
B.1.7pH7.0~7.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
B.2NGM培养基(1L)
B.2.1营养琼脂(BectonDickinsonandCompanySparks,MD)23g。
B.2.2甘油(1%v/v)10mL。
B.2.3四水氯化锰0.4g。
B.2.4pH6.5,121℃高压蒸汽灭菌10min。
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附录C
(规范性)
常规PCR检测方法
C.1引物及序列
Ddad5(5’-gtctgcagagcagtatcaatc-3’)/Ddad9(5’-aaacttcaacggcaaagcg-3’)。
C.2反应体系
25μL反应体系:
10×PCRBuffer2.5μL,Mg2+2μL,dNTP(10mmol/L)2μL,正反向引物(10μmol/L)各1μL,模板DNA1μL,Taq酶0.2μL(1u),ddH2O15.3μL。
C.3反应程序
PCR反应程序为:
94℃预变性3min,94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环;72℃延伸5min。
反应参数可根据不同仪器的要求作适当调整。
C.4琼脂糖凝胶电泳分析
PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测,凝胶成像系统观察拍照,预期扩增片段大小为222bp。
C.5结果判定
在阳性对照、阴性对照和空白对照均正常的情况下,检测样品出现与阳性对照大小一致条带,判定为阳性,否则为阴性。
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附录D
(规范性)
实时荧光PCR检测方法
D.1引物、探针及序列
D.1.1引物为Ddad3(5’-acccaggccaccagaagt-3’)/Ddad4:
5’-gacggtactgttaccgctac-3’。
D.1.2TaqMan探针ADdad(5’-FAM-cagtggtgcctgcgccaac-MGB-3’)。
D.2反应体系
25μL反应体系:
荧光PCRPremix12.5μL,引物Ddad3(5μmol/L)1μL,引物Ddad4(5μmol/L)1μL,TaqMan探针(10μmol/L)1μL,ROXReferenceDyeII0.5μL,模板DNA1μL,ddH2O8μL。
D.3扩增程序
95℃预变性10s;95℃变性15s,63℃退火延伸1min,40个循环。
D.4结果判定
在阳性对照、阴性对照和空白对照均正常的情况下,凝似分离物出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性。
检测样本出现典型扩增曲线,且Ct值≤35时,则判定为阳性;35<Ct值<40,增加DNA用量至2μL~5μL再次检测,出现典型扩增线,且Ct值≤35时,则判定为阳性;其余情况判定为阴性。
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附录E
(规范性)
MALDI-TOF-MS鉴定
E.1样品的准备和鉴定
在NA培养基上28℃培养24h挑取单菌落,直接涂抹到质谱专用靶板上,再将肉桂酸(HCCA)基质1µL滴在样本上,自然干燥后,在MALDI-TOF质谱仪上进行测定,线性扫描质量范围设定为2000~20000。
所获得的质谱图用微生物鉴定分析软件BioTyper直接进行MBT菌株数据库检索完成鉴定。
E.2结果判定
MALDI-TOFMS质谱技术对微生物种属鉴定的判断标准是:
分值在2.300~3.000,完全可靠地鉴定到种,2.000~2.299鉴定到种,1.700~1.999鉴定到属,0.000~1.699鉴定结果不可用。
当供测菌株或菌落的质谱图谱与BrukerMBT菌株数据库中的D.dadantii质谱图比较,鉴定分值大于2.000时,判定为阳性,否则为阴性。
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- 国家 地方 技术规范 甘薯 病菌 检疫 鉴定 方法