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武汉大学细胞生物学课件
第一章绪论
第一节细胞生物学的研究内容和概况
一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科
1、什么是细胞生物学(cellbiology)?
细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学,是现代生命科学的重要基础学科之一;它从显微、亚显微和分子三个层次以动态的观点来研究细胞和细胞器结构与功能,探讨细胞的各种生命活动规律。
2、细胞是所有生物体(不包括病毒)结构和生命活动的基本单位
特点:
自我复制、自我装配和自我调控;
通过与外界物质和信息交流,保持自身动态平衡;
多层次、非线性、多侧面性。
病毒、生物大分子和细胞的关系
“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”
“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”
补充2008OsamuShimomura,MartinChalfie,RogerY.Tsien。
Chemistry,绿色荧光蛋白
2007MarioR.Capecchi,MartinJ.Evans,OliverSmithies。
M&P,基因靶向技术
二、细胞生物学的主要研究内容(P3)
1)细胞核、染色体以及基因表达
细胞生物学、分子遗传学、发育生物学共同关注的焦点之一,研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系。
2)生物膜与细胞器
生物膜——细胞质膜和细胞内膜的总称,细胞物质交换、能量转换、信息交流的关键功能部位。
细胞器学——探讨细胞器的结构和功能。
3)细胞骨架体系
4)细胞的增殖与调控
5)细胞的分化与调控
6)细胞的衰老与凋亡
7)细胞的起源与进化
8)细胞工程
三、细胞生物学研究的总趋势p5
生命科学的基本问题
基本问题:
遗传发育进化
主要内容:
细胞的生命活动
切入点:
功能基因组
动物学植物学(微生物学)----整体水平
细胞生物学---细胞水平
分子生物学----分子水平
总的趋势:
从分子水平-------细胞水平
20世纪21世纪
结构与功能-------细胞生命活动
生物大分子-------复合物
单一基因与蛋白------基因组与蛋白质组
调控途径------调控网络
静态------动态
invitro------invivo(模式生物,人)
生物学------多学科交叉(理论和技术)
理论------应用
分析------综合
一)细胞生物学总趋势:
细胞生物学与分子生物学相互渗透和交融——分子细胞生物学
二)细胞学研究重点领域:
3大基本问题(p5);
若干重大课题(p6)。
本节小结
一、什么是细胞生物学
二、细胞生物学的研究内容
三、细胞生物学研究的总趋势、重点领域
功能基因组学
基因组学genomics:
1986年ThomasRoderick(美)提出。
指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。
功能基因组学:
又往往被称为后基因组学(postgenomics),它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因(蛋白质)的研究转向多个基因(蛋白质)同时进行系统的研究。
结构基因组学(structuralgenomics)
基因组研究以全基因组测序为目标
功能基因组学(functionalgenomics)
以基因功能鉴定为目标
近十年的回顾与展望p7
美国科学情报研究所(ISI)1997年以来SCI(ScienceCitationIndex)收录及引用论文检索,全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是:
细胞信号转导(signaltransduction);细胞凋亡(cellapoptosis);基因组与后基因组学研究
(genomeandpost-genomicanalysis)
-----------genomics和proteomics:
Whatispopularinresearchtoday
美国国立卫生研究院(NIH)在1988年底发表的一份题为《什麽是当今科研领域的热门课题?
》的调查报告中指出:
三种主要疾病:
癌症(cancer)心血管病(cardiovasculardiseases)爱滋病和肝炎等传染病(infectiousdiseases:
AIDS,hepatitis)
五个主要研究方向
细胞周期调控(cellcyclecontrol);细胞凋亡(cellapoptosis);
细胞衰老(cellularsenescence);信号转导(signaltransduction);
DNA的损伤与修复(DNAdamageandrepair)---染色质水平的研究
第二节细胞生物学发展简史
五个阶段
一、细胞的发现p8
1665年RobertHooke(英)(30×)“cellar”——cell
1677年LeeuwenHoek(荷兰)(300×)活细胞观察,第一次观察到人和动物的精子。
二、细胞学说的建立p9
1838-1839Schleiden和Schwann(德)分别提出了细胞学说(celltheory);
基本内容:
所有生物都是由一个或者多个细胞构成的;细胞是生命的基本单位。
1858年RodulfVirchow(德)对细胞学说进行了重要补充:
细胞只能来自细胞。
意义:
19世纪自然科学三大发现之一;现代生物学三大基石之一。
三、细胞学经典时期——19世纪的后25年(P10)
原生质理论的提出:
protoplasm
1861年,MaxSchultze:
有机体的单位是一小团原生质,这种物质在一般有机体是相似的。
细胞分裂的研究:
有丝、减数分裂;
重要细胞器的发现。
四、实验细胞学、细胞学分支及发展(1900-1953)(P10)
experimentalcytology——用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。
细胞遗传学;细胞生理学;细胞化学
五、细胞生物学学科形成、发展(20世纪50年代——)(P12)
1953年DNA结构的发现——分子生物学诞生;
1965年,DP.Derobetis将《普通细胞学》改为《细胞生物学》,标志着细胞生物学的诞生。
新研究技术手段的促进:
电子显微镜、超薄切片、扫描隧道显微镜、细胞化学、分子生物学……
80年代:
分子细胞生物学(MolecularCellBiology)
细胞生物学发展历史(本节小结)
1、细胞的发现、细胞学说的创立(1665~1874);
2、细胞学的经典时期(1875~1900);
3、实验细胞学时期(1900~1953);
4、细胞生物学的诞生和发展(1953~)
附:
细胞生物学学习方法
1、细胞是生命结构和功能的基本单位,细胞生物学在生命科学研究领域具有重要地位——重视《细胞生物学》
2、明确细胞的结构和功能的一致性;
3、从显微、亚微和分子三个层次来认识细胞的结构与功能;
4、和多学科知识相结合,同分子生物学、生物化学、遗传学、生理学等课程紧密联系;
5、注意细胞生物学各章节之间内容的相互关联;
6、关注学科前沿;关注新技术方法进展;学习一点科技史。
第二章细胞的统一性和多样性
本章内容
一、几个重要名词;
二、细胞的基本概念(非细胞形态的生命体—病毒);
三、原核细胞和古核细胞;
四、真核细胞;
一、几个重要的名词概念
细胞膜cellmembrane(或称质膜plasmamembrane)+细胞质cytoplasm
+细胞核nucleus(或拟核nuleoid)=细胞cell
原生质protoplasm被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质,包括细胞核和细胞质。
细胞质cellplasma是指细胞内除核以外的原生质,即细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分。
原生质体protoplast“细胞”的同义词,多专指除去细胞壁的植物细胞和细菌。
(工程性概念)
内膜系统endomembranesystem细胞内部的膜相结构,包括细胞器膜和核膜。
细胞器cellorganelle细胞质中具有一定形态、固定化学组成和特定生理功能的结构物。
外质ectoplasm细胞内靠近质膜的细胞质部分。
内质endoplasm细胞内靠近核膜的细胞质部分。
细胞质基质cytoplasmmatrix/cytomatrix又称为胞质溶胶(cytosol),指细胞质中除去细胞器以外的胶体液态部分。
二、细胞的基本概念(P19)
1、细胞是生命活动的基本单位。
2、细胞的基本共性:
p21
相似的化学组成、生物膜(脂-蛋白体系)、DNA—RNA遗传装置、核糖体、一分为二的分裂方式。
上述4个特征也是判断是否细胞的特征。
病毒不是细胞,因为:
①病毒没有质膜;
②病毒仅有一种核酸;
③病毒没有核糖体蛋白合成体系;
④病毒不分裂,靠宿主细胞复制增殖。
病毒与细胞的起源关系P44
生物大分子——细胞——病毒
由于:
病毒的寄生性;
某些病毒的核酸同细胞DNA的序列相似性;
病毒同核蛋白分子的相似性;
第二类反转录转座子两端LTR与反转录病毒的相似性。
三、原核细胞和古核细胞
1、最小最简单的细胞——支原体
最小的细胞:
拟胸膜肺炎支原体PPLO(Φ0.1μm);
鸡蛋结构
2、细菌和蓝藻
细菌:
拟核(nucleoid)、细胞质膜的多功能性、中膜体、细胞壁、核糖体、质粒。
蓝藻:
中心质、光合片层。
3、古核生物(古核细胞、古细菌)(P29)
如产甲烷球菌、盐细菌、热原质体、硫氧化菌等;
现认为归并为原核生物和真核生物外的第三界,有可能是真核细胞的祖先;
与真核细胞相似处:
①细胞壁成分;②DNA中的重复序列、基因中的内含子;③组蛋白和DNA组成核小体类似结构;④核糖体对抗生素的反应;⑤5srRNA序列及二级结构
四、真核细胞p31
1、真核细胞的基本结构体系
1)蛋白质和脂质构建的膜相结构体系(细胞膜、核膜、各种细胞器膜);
2)蛋白质和核酸构建的遗传信息结构体系(染色体、核仁、核糖体);
3)蛋白质和蛋白质构建的细胞骨架结构体系(微管、微丝、中间纤维)。
2、细胞的大小
细胞表面积与体积的关系,为何细胞体积微小?
①相对较大的表面积,有利于物质的交换和保持新陈代谢;②保证遗传指令的对细胞的控制;③保证细胞中物质的传递。
同类型细胞的体积一般是相近的,不依生物个体的大小而增大或缩小。
如人、牛、马、鼠、象的肾细胞、肝细胞的大小基本相同;
“细胞体积的守恒定律”——
器官的大小主要决定于细胞的数量,与细胞的数量成正比,而与细胞的大小无关。
4、原核细胞和真核细胞的比较
原核细胞prokaryoticcell(原核生物prokaryote)如细菌、蓝藻、衣原体、立克次氏体、螺旋体等;
真核细胞eukaryoticcell(真核生物eukaryote)如真菌、藻类、原生生物、高等植物、高等动物等。
原核细胞和真核细胞基本特征的比较p35
①生物膜系统的分化和演变,使细胞内部结构和功能更复杂和高级,形成核和质两大区域,并形成多种细胞器,保证各种物质代谢过程互不干扰,有序进行,各区域分工明确精细、专一;
②遗传物质和遗传结构装置的扩增和复杂化,使遗传信息更加稳定,基因转录和翻译有严格的阶段性和区域性,基因表达调控有多层次性;
核膜、染色体、内含子、重复序列、间隔序列、假基因……转录前、转录、转录后、翻译、翻译后水平的调控。
总之,真核细胞是更高级的细胞类型
表2-2补充原核细胞和真核细胞的比较P36
5、植物细胞和动物细胞的比较(P44)
植物细胞特有的细胞结构:
细胞壁、液泡、叶绿体
膜相结构双膜:
核膜、线粒体、叶绿体
单膜:
内质网、高尔基体、溶酶体、液泡、圆球体、微体等
非膜相结构颗粒结构:
核糖体、中心体、基体
线状结构:
染色质纤维、核仁纤丝、微管、微丝、中间纤维、微梁网架。
关于纳米细菌(nanobacteria)
过去认为纳米细菌可能参与人类肾结石形成、心血管疾病以及癌症,它们不仅是活的,而且和疾病相关联;
台湾长庚大学杨定一实验发现:
体外CaCO3沉淀在大小、膜泡形状、类细胞分裂行为、群体集合等方面同纳米细菌非常相似;
培养的人类血清中纳米细菌状的颗粒正如CaCO3一样,其外观如大小、形状都会受到CO2和NaHCO3水平的影响;
Westernblotting显示,对纳米细菌特异的单克隆抗体,实际上是同血清白蛋白相反应;
人血中获得的纳米细菌样颗粒,可以耐受高达30kGy的同位素照射;各种广泛的PCR扩增未发现DNA。
因此,纳米细菌可能是一种非生命体。
现存动物中最大的卵,是海洋中的鲸鲨的卵。
据记载1953年,在墨西哥湾的海底,捕到一颗鲸鲨卵,长30.5厘米,宽14厘米,高89厘米(比篮球还大)是目前已知最大的卵。
内有一条长36厘米长的鲸鲨胎儿。
动物受精卵发育方式:
卵生;卵胎生;胎生
Prion朊
第三章细胞生物学研究方法
第一节细胞形态结构的观察方法
一、光学显微技术(P49)
1、普通复式光学显微镜技术
①组成:
光学放大系统、照明系统、机械系统;
②性能参数:
放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等,其中最重要的是分辨力。
分辨力(分辨率、分辨本领):
能分辨两个物点之间最短距离的能力。
该距离越小,则分辨力越高。
显微镜的分辨力计算公式:
③普通光镜分辨极限
α最大值140°;λ最小波长450nm;N最大值1.5;
因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米,此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。
(称为瑞利极限,Rayleighlimit)
普通光镜有效放大倍数(经验值)=物镜最大镜口率×1000
④提高光学显微镜分辨力的手段
a、缩短照明光线波长;
b、应用特殊光学效应,增强反差。
光学显微镜样品制备
固定(fixation):
使用固定剂(fixative)杀死细胞,并使细胞结构尽可能接近活细胞;
脱水:
乙醇包埋:
石蜡切片:
切片机脱蜡、染色:
多种染料封片:
长期保存
显微镜技术和计算机技术结合倒置显微镜
2、相差和微分干涉显微镜技术(P51)
①相差显微镜:
(phasecontrastmicroscope,Ph)
1935年荷兰物理学家FritsZernicke发明;它利用光的衍射和干涉原理,将光的相位差(人眼无法感受)→振幅差(人眼可以感受);
无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比;适合观察活细胞和未染色的样品。
两束光波之间的相互干涉
普通光学显微镜相差显微镜
②微分干涉显微镜(P51)(differential-interferencemicroscope,DIM)
DIM获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。
样品边缘结构反差增大(相对小的距离内折射率发生明显变化)。
Nomarskimicroscope荐阅读《细胞实验指南》下册,科学出版社,P896
3、荧光显微镜技术(fluorescencemicroscopy)
①原理:
以紫外光为光源,激发标本中的荧光物质产生荧光,从而对某些物质进行定性和定位分析。
②荧光种类:
自发荧光:
细胞内某些天然物质被UV激发产生的荧光,如叶绿素产生血红色荧光。
诱发荧光:
细胞中加入荧光染料,与特定成分结合,经过UV照射发出荧光。
荧光显微镜的工作原理;OlympusBX-51荧光显微
4、激光扫描共聚焦显微技术(P53)(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)
5、荧光共振能量转移技术(P54)(FRET)
二、电子显微镜技术(P56)
1、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)
电子显微镜是模仿光学显微镜的工作原理,用电子束来代替可见光束,用电磁线圈代替玻璃透镜汇聚电子束,通过荧光屏或者胶片捕获图像的观察工具,理论分辨率可达0.2nm。
表3-1电子显微镜和光学显微镜的基本区别
HITACHIH-8100透射电子显微镜
电子显微镜基本构造(P57)超薄切片制备
2、透射电镜特点:
①“照明”光源——电子束
②放大倍数调节方式——改变磁透镜电流强度
③高电压工作——几万~十几万伏
④内部高真空——10-4托
⑤样品厚度<90nm——电子穿透力有限,产热
⑥标本染色技术不同——重金属盐(正染,负染)
⑦冰冻蚀刻(冰冻断裂)技术freeze-etching(freeze-fracture)
样品于-190℃快速冰冻——在真空中用冷却刀切割撕裂——真空中冰升华——暴露出的断裂面喷碳膜或者碳-铂膜(表面复型膜)——用有机溶剂或酶去除样品——将膜金属喷镀后在电镜下观察
冰冻蚀刻
2、扫描电子显微镜(P62)(scanningelectronmicroscope,SEM)
SEM发明于1965年;工作原理:
利用电子束逐点扫描样品表面,通过检测样品表面散发的二次电子,将样品表面的形貌逐点成像,并合成为放大的图像。
扫描电镜的特点:
①可观察较大较厚的样品;
②景深大,获得的是清晰逼真的三维立体图像;
③放大倍数在20~20万倍间连续变换,无需多次聚焦;
④样品可在样品室内多方位移动和转动;
⑤分辨力不太高:
3~10nm
⑥只能观察标本表面,不能观察内部。
三、扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM)(P63)
1981年发明;用于探测物质表面形貌的仪器;利用量子力学中的隧道效应。
扫描隧道电镜下的DNA双螺旋
STM的特点:
①具有原子尺度的高分辨本领;
②真空、大气、液体环境中都能工作;
③非破坏性测量,保持样品原貌。
原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)
第二节细胞组分的分析方法
一、超速离心技术(P64)
离心技术原理:
不同的细胞器具有不同的密度和体积,因此,可以利用离心方法加以分离和纯化。
1、差速离心(differentialcentrifugation)
利用不同的离心速度产生的不同的离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。
适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。
多次离心达到纯化的目的。
2、密度梯度离心(P65)
①速度沉降——分离密度接近大小不一的组分
②等密度沉降——分离不同密度的组分
将介质形成一涵盖所有组分密度的密度梯度,不同的样品由于其密度差异,在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动,从而实现分离的目的。
速度沉降和等密度沉降的比较
二、组织化学和细胞化学(P65)
利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合,来判断核酸、蛋白质(酶)、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。
福尔根(Feulgen)反应——显示DNA
格莫瑞(Gomori)反应——显示碱性磷酸酶
三、特异蛋白抗原的定位与定性P66
原理:
抗体能够自行识别并结合对应的抗原
目的:
检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。
(一)免疫荧光技术
(二)免疫电镜技术
人成纤维细胞中肌动蛋白束(800×)
BHK细胞中的微管蛋白(500×)
四、细胞内特异核酸序列的定位和定性
研究对象:
细胞内特异核酸(DNA或RNA)
目的:
定位、定量分析
方法:
原位杂交(insituhybridization,ISH)
以目标核酸的互补序列为探针,对细胞或者组织标本进行杂交处理,使目标核酸可视呈现的技术。
是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。
构建DNA分子物理图谱
光谱核型分析(spectralkaryotype,SKY)SKYofHuman
五、放射自显影研究生物大分子(略)
六、定量细胞化学分析技术P69
细胞分选(cellsorting):
是细胞生物学中较新技术,是利用流式细胞仪(flowcytometery,FCM)对细胞或者其他生物微粒(如染色体)进行分选,并对其进行定量分析(大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等)的技术。
1、流式细胞仪(FCM)
是集合了流体喷射、激光、伽马射线能谱、电子计算机、显微荧光光度计量等技术于一体的设备;
可以定性和定量分析生物颗粒(包括细胞)的物理化学特性并将之分离纯化;
目前的FCM已经运用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血清学、药物学等研究领域,可以用来分析免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞、简单多细胞生物等等。
流式细胞仪结构和工作原理
2、标记细胞:
免疫荧光染色:
荧光素标记抗体:
异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红素(PE)、德克萨斯红(TexasRed)
荧光染色分为:
直接染色和间接染色
荧光染料直接染色使用PI(碘化丙啶,propidiumiodide)或DAPI,对固定处理过的细胞(核)直接进行染色
第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养P70
1、什么是细胞培养
是指从机体内取出某种组织或者细胞,模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。
2、细胞培养分类:
按照培养过程中培养物是否经过了分割,分类为:
①原代培养(primaryculture)
②继代培养(secondaryculture)/传代培养(subculture)
①原代培养(primaryculture)
直接从机体取出组织或者细胞后所进行的首次培养。
②继代培养(secondaryculture)/传代培养(subculture)
当原代培养的细胞增殖到一定的密度后,将其从原培养容器中取出,按照一定的比例向另外一(多)个容器中接种所进行的再培养,简称传代。
传代的累计次数就是细胞的代数。
两个概念
细胞系(cellline):
通过原代培养并且经过传代后所形成的细胞群体,由于来源于原代培养物,故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体组成。
如HeLa、CHO等。
细胞株(cellstrain):
利用单细胞分离培养法或者克隆形成法从原代培养物或者细胞系中选择出来的细胞群体,一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或者标记,并且可以持续存在。
二、细胞工程(cellengineering)
细胞水平的生物工程。
(一)细胞融合与细胞杂交
1、细胞融合(cellfusion)——两个或者多个细胞融合成双核或者多核细胞的现象。
产生的细胞称为融合细胞。
2、细胞融合的应用:
动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合,并且动植物之间的细胞可以融合,从而培养成各种性状的杂种细胞。
细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。
3、人工诱导细胞融合:
病毒诱导融合:
灭活的仙台病毒等;化学诱导融合:
PEG;电激诱导融合。
(二)单克隆抗体技术
(三)细胞显微操作技术
基因敲除(knockout)
模式生物p76:
个体较小,容易培养,操作简单,生长繁殖快速
第四章细胞质膜
第一节细胞质膜的结构模型
一、生物膜的结构模型P83
1、ErnestOverton(1895)发现:
溶于脂肪的物质很容易透过植物的细胞膜;
不溶于脂肪的物质则不易透过。
——推测细胞膜由连续的脂类物质组成。
2、E.Gorter和F.Grendel(1925)发现:
红细胞质膜的脂类成分在水面展开的
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