张艳霞 论文 1.docx
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张艳霞 论文 1.docx
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张艳霞论文1
摘要
在PH=7.4Tris-HCl缓冲溶液中,运用荧光光谱技术分别在295K、303K、310K、317K温度下,研究了Mn2+和Ni2+对木犀草素与BSA相互作用体系的影响。
实验结果表明,在Mn2+和Ni2+存在下,BSA与木犀草素的猝灭明显加强。
由H0,S0可以得出G=H-TS0,可知木犀草素与牛血清蛋白之间主要存在静电作用力。
根据双倒数方程计算出,BSA与木犀草素最大扩散碰撞猝灭速率常Kp>2.0×1010,他们之间的猝灭为静态猝灭。
关键词:
木犀草素;Mn2+和Ni2+;牛血清蛋白(BSA);相互作用
Abstract
InthePH=7.4Tris-of-HClbuffersolution,atthetemperatureof295K,303K,310K,317Kusingfluorescencespectroscopy,theinfluenceofMn2+andNi2+havingontheinteractionsystemofluteolinandBSAwasstudied.TheexperimentalresultsshowthatintheexistenceofMn2+andNi2+,thequenchingofBSAandluteolinsignificantlystrengthened.AccordingtoH0,S0canobtainG=H-TS0,itcanbeseenthatthereareelectrostaticinteractionsbetweenluteolinandbovineserumalbumin.Accordingtothedoublereciprocalequation,wecancalculatetheBSAandluteolinmaximumdiffusioncollisionquenchingrateKp>2.0×1010,Betweenthemthequenchingisstaticquenching.
Keywords:
Luteolin;Mn2+andNi2+;fluorescencequenching;bovineserumalbumin(BSA);fluorescencequenching
前言
血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,与各种小分子都有一定程度的相互作用,当药物进入人体或动物体后首先会与血清蛋白结合,通过血浆的存储与运输到达受体部位,从而长生药理作用。
研究蛋白质的变化可为诊断疾病提供有价值的信息,同时对保持人体的健康有重要意义,所以研究药物与血清蛋白的相互作用[1]机制已成为药学领域研究的热点。
药物小分子与血清白蛋白之间的相互作用研究目前使用的一些方法主要有:
荧光光谱法[2]、紫外可见吸收光谱法、电化学法、极谱分析法等。
荧光光谱法是最普遍最有效的一种研究方法,因为荧光法能提供荧光强度、激发光谱、发射光谱等物理参数,更好更准确的研究蛋白质的性质、结构及功能。
Mn2+和Ni2+都是生物体必需的重要金属元素,生物体缺少或摄入量过多锰和镍都会引起病变,影响机体的正常运行。
目前,采用荧光光谱法对金属离子与血清蛋白的相互作用及药物分子与血清蛋白相互作用的研究比较多,文献已经报道了Cu2+、Zn2+等与血清蛋白及各种药物与血清蛋白的相互作用。
木犀草素(Luteolin)是黄酮类化合物的一种,具有抗菌、抗炎、祛痰、抗癌、利尿等多种功效。
实验中在pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液中。
采用荧光光谱技术研究了Mn2+和Ni+与牛血清蛋白以及木犀草素与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,并探讨了作用机理及各个参数。
实验结果表明木犀草素与BSA的相互作用与别的黄酮类化合物情况相似,都能对BSA的产生明显的荧光猝灭,。
猝灭方式为静态猝灭,当加入Mn2+或者Ni2+时会明显增加木犀草素与BSA相互作用的静态猝灭作用[3,4]。
1文献综述
1.1蛋白质
18世纪时,安东尼奥·弗朗索瓦(AntoineFourcroy)和其他一些研究者发现蛋白质是一类独特的生物分子,他们发现用酸处理一些分子能够使其凝结或絮凝。
当时他们注意到的例子有来自蛋清、血液、血清白蛋白、纤维素和小麦面筋里的蛋白质。
荷兰化学家格利特·马尔德(GerhardusJohannesMulder)对一般的蛋白质进行元素分析发现几乎所有的蛋白质都有相同的实验公式。
1838年永斯·贝采利乌斯提出用“蛋白质”这一名词来描述这类分子。
蛋白质是一种复杂的有机化合物,由一条或多条多肽链组成的生物大分子,每个氨基酸按一定的顺序排列。
蛋白质分子上氨基酸的序列和由此形成的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。
蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构。
蛋白质是构成生命的非常重要的物质,是组成机体细胞的重要结构,是人体组织保持正常生命活动的重要原料。
人体的每个组织例如肌肉、骨骼、毛发内脏、神经、大脑、皮肤、血液、内分泌等都是蛋白质组成的,在细胞和生物体的生命活动过程中起着十分重要的作用。
蛋白质还参与基因表达的调节,以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。
关于蛋白质的研究是当前临床医学、化学、及生命科学研究的重要课题特别是对药物与蛋白质大分子的相互作用的研究[5,6]。
通常通过建立蛋白质与药物相结合的体外模型,研究结合起来的紧密度,结合部位,结合力,结合数的问题,既可以方便认识蛋白质与小分子在分子层次上的规律和作用机理,认识到蛋白质结构与蛋白质功能的关系,为相关科学研究提供有价值的依据,还可以正确认识药物的药效作用以及药物毒理[7],为新药研发和药物分子筛选提供了有力的启发和指导作用。
1.2金属离子对人体的影响
到目前为止,人们已经发现90种天然金属元素,而人体内就有60种,其中29种是人体必需的金属元素。
由于许多金属离子在生命过程中有着特殊的地位和作用,现在科学已将无机化学和医学紧密联系在一起,通过一些相关科学的研究,一些金属离子,例如钠、钾、镁、钙、铁、锰、镍、铝、铜等,在医学及其对人体健康的影响已近显得尤为重要。
这些离子通过与蛋白质、核酸、维生素、激素、代谢物等生物配合体形成金属蛋白金属酶等生物配合物,在生命过程中发挥着极其重要的生化及其生理作用。
任何一种人体必需的金属元素,如果在人体中含量过高或过低,都可能导致病态[8],因此保持其在人体内的正确剂量极其重要。
锰是人体必需的微量元素之一,它构成体内若干种有重要生理作用的酶,正常人每天从食物中摄入锰3—9mg。
人体内缺锰会引起锰缺乏症,但锰过多(如长期接触锰化物时)又可造成中毒。
慢性锰中毒一般在接触锰的烟、尘3—5年或更长时间后发病。
严重锰中毒可引起肾小管上皮细胞退行性变,肝脂肪变性,心肌和肌肉纤维可有水肿和退行性变,肾上腺缺血和部份坏死。
镍是人体必需的生命元素,在自然界分布极广,但在人体内含量极微。
正常情况下,成人体内含量约为10g,血液中的浓度为0.11g/mL。
镍具有刺激血液生长的作用,能促进红细胞再生。
补充适量的镍可使红细胞、白细胞及血红蛋白的生成增多。
患有各种贫血及肝硬化的病人血中镍均降低,镍有刺激生血功能的作用。
镍可参与多种酶蛋白的合成和细胞激素及色素的代谢,具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶,增强胰岛素,降血糖,保护心血管等作用。
缺镍可引起糖尿病、贫血、肝硬化、肾衰和肝脂质和磷脂代谢异常;镍含量过高会导致中毒使人易患鼻咽癌肺癌,因此保持其在人体内的正确剂量极其重要。
1.3木犀草素
木犀草素是天然黄酮类化合物的一种,木犀草素在自然界中分布广泛,由于起初是从木犀草科(Resedaceae)木犀草属草本植物木犀草(ResedaodorataL.)的叶、茎、枝中分离出而得名,可从多种天然药材、蔬菜果实中分离得到。
目前发现主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄芩属等天然药材中,以及芽甘蓝、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜、胡萝卜、芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中,其它如橄榄油和红酒等植物产品以及野凤仙花、百里香草、唇形科植物全叶青兰草、筋骨草等也含有木犀草素。
大多数以糖苷的形式存在于植物中,具有祛痰和镇咳的作用。
最新研究表明,呼吸道症状的咳嗽、咳痰、喘息,均与气道慢性炎症有关。
例如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、变应性鼻炎、慢性咽炎等引起咳痰、咳嗽、喘息,都被认为与局部的炎症浸润有关,炎症的存在使得气道的免疫应答混乱,所以患者会常出现气道反应性增高。
治疗手段应该首先消除气道的慢性炎症的浸润。
当前常用糖皮质激素来消除气道炎症。
但是糖皮质激素的副作用很多,不能长期应用。
研究发现,木犀草素可以抑制巨噬细胞磷酸化,还可以抑制转录因子NF-kB的活性及脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞产生细胞因子。
IL-6、TNF-a在炎症机制中扮演非常重要的角色,是反映炎症程度的重要指标。
木犀草素还可以提高IFN-γ,同时降低特异性Ig-E,降低嗜酸性粒细胞的浸润。
木犀草素不但有抗炎、抗过敏作用,而且还具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性,通过抑制SARS病毒前S蛋白的活性,来阻止其进入宿主细胞。
从而治疗支气管哮喘、COPD、慢性咽炎、以及变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。
结构式:
木犀草素又名3,4,5-四羟基合酮,
分子式:
C15H10O6,分子量为:
286.24,木犀草素为黄色针状结晶体,微溶于水,具有弱酸性,可溶于碱性溶液,熔点为328-330℃,一般条件下稳定。
具有抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗炎症性脱髓鞘疾病、抗纤维化、抗生育与激素作用、对血管的作用。
1.4药物与蛋白质相互作用的研究现状
1.4.1研究方法
(1)荧光分析法
荧光光谱法是最普遍最有效的一种研究方法,因为荧光法能提供荧光强度、激发先谱、发射光谱等物理参数,更好更真确的研究蛋白质的性质、结构及功能。
一般情况下,分子药物与蛋白质相互作用可以引起两种体系中荧光的性质改变;其中一种情况为药物分子没有荧光,但当药物加入蛋白质溶液后会引起蛋白质内源荧光的猝灭作用;另一种情况为药物有荧光,将药物与蛋白质进行混合后内源荧光发生猝灭,而且敏化增强了药物分子荧光。
荧光技术中还能测定药物与蛋白质的结合位点和结合常数。
在测时首先要确定荧光猝灭是什么类型,荧光猝灭分为动态猝灭、静态猝灭,还有能量转移猝灭。
动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程:
F0/F=1+KSV[Q]=1+Kq0[Q],对上式进行取对数可得:
Log[F0/F-1]=LogK-nLog[Q],作图Log[F0/F-1]—Log[Q]斜率为结合为点数,通过截距求得KSV。
例如,2009年安红波等人用荧光法研究了竹红菌甲素与牛血清白蛋白的相互作用。
2011年10月,杨金元[9]等人也发表了,刺芒丙花素与BSA的相互作用的荧光法研究。
(2)紫外—可见吸收光谱法
当药物分子与蛋白质结合后分子结构会发生变化,原来的吸收峰会发生红移或者蓝移,吸收峰宽度也有可能发生变化,因此可以小分子与研究蛋白质间结合力的强弱及结合机理。
紫外—可见吸收光谱法通常与荧光发射光谱利用二者图形的重叠部分互相补充,按能量转移定理计算出小分子与蛋白质之间的相互距离。
例如,高炅杨[10]等人2009年就发表了,用紫外光谱法研究邻相草醛缩苯丙氨酸席夫碱牛血清白蛋白的相互作用。
(3)电化学方法
现在很多数科学家都认为大多数生物化学反应过程其本质上是电化学过程,因为电势和电流在生物现象的大多数方面都涉及到了,所以要说明这些现象必须利用电化学。
目前此法被广泛应用。
主要采用电位法和安培法对蛋白质进行定量分析,利用蛋白质本身具有的氧化还原波同蛋白质的催化氢波对蛋白质进行定性分析。
例如,张辉[11]、李丽、田燕妮等人2011年发表了,牛血清白蛋白与Cu(
)、Zn(
)相互作用的表面电化学研究。
(4)色谱法
色谱法最初就用来测定药物与蛋白质的结合参数,但由于它柱效低、柱寿命短一直没有受到重视,近年来高度自动化系统得到了应用和发展,使采用色谱法得到结合数据精密度和重现性优于常规方法,目前也得到广泛应用。
(5)毛细管电泳法
通过观察被分析物在特定的电泳环境中的迁徙特征,能定量的获得被分析物与媒介的反映情况。
亲和毛细管电泳技术是近几年发展起来的,它是一种测量蛋白与小分子结合常数的毛细管电泳新方法,虽然也包括很多不同的试验技术,但却都属于同一原理。
例如,仲淑贤[12]、王卫平、陈建荣等人2011年发表了SiO2纳米粒子在毛细管分离蛋白中的应用.
(6)傅里叶红外光谱法
傅里叶红外光谱与傅里叶自转积以及二阶导数谱的分析,可用于二级结构的指认,已成为一种研究蛋白质与小分子相互作用的新途径。
例如,王靖[13]、郭晨、梁向峰等人2006年发表了利用傅里叶变换红外光谱对阴离子便面活性剂SDO与牛血清蛋白相互作用的研究。
(7)其他方法
除以上的常用方法外,还有反胶束[14]、单扫描极谱法[15]、核磁共振技术和蛋白质结构模拟等方法。
总之,随着人们对血清白蛋白的三级结构的清晰了解,使得小分子—蛋白质相互作用的研究进入了新的阶段,对药物与蛋白质相互作用情况的预测也有了更加坚实的理论基础,各种方法和手段进行全方位的研究才能得到可靠的结论。
1.4.2研究进展
近年来,关于小分子与蛋白质相互作用的研究已经成为热点研究,药物小分子与蛋白质间相互作用的研究更是引起人们的广泛兴趣和共同关注。
药物小分子与蛋白质间相互作用的研究不仅有助于从分子水平上了解蛋白质与小分子的作用机理以及规律,而且有助于认识药物的转运和运输。
将小分子药物结合在大分子载体上,可以在血液中更长的停留,使药物可以控制释放,达到更长的药效,并且在减少透视药物的同时降低药物的毒性,蛋白质作为一种典型的大分子在生物体内占重要位置,在各个生命活动中起重要的作用,对药物与蛋白的研究对理解蛋白质的结构与功能有重要作用意义。
目前,对于药物与蛋白质的研究主要集中在药物小分子与血清蛋白的研究上,血清蛋白主要是牛血清蛋白[16](BSA)和人血清蛋白(HSA),白蛋白是主要的血清蛋白,可以与很多外源性和内源性的化合物结合,通过形成复合物来完成血浆的功能。
药物进入生物体后,只能通过血浆的存贮和运输,才能达到病变部位,进而发挥药效。
随着科学技术的发展和新技术的引入,这方面的研究内容也在不断地深入。
血清蛋白作为血浆中含量最丰富的蛋白质,它作为许多内源性和外源性化合物的转运蛋白,可以与很多化合物分子发生相互作用。
其中作用之一就是在体内作为药物的载体,在生物体内起到运输作用,负载各种药物小分子到达病灶部位,蛋白质与药物的相互作用研究为蛋白质临床检验提供了有效的方法,药物与血清蛋白质结合时药物的暂时储存形式,是控制药物向受体释放、避免药物迅速代谢的主要途径。
因此,研究药物小分子与血清蛋白的相互作用,对了解药物在人体内的吸收、排泄、分布、毒性和药理活性都有重要的意义
学者运用了各种研究方法对蛋白质与小分子间的相互作用进行了研究,研究的主要方法有荧光法光谱法、紫外-可见吸收光谱法、电化学[17]、平衡透析法、毛细管电泳法、傅里叶红外光谱法,随着技术的完善[18],核磁共振、激光拉曼、毛细管脉等方法的运用也比较广泛,另外,计算机技术的分子模拟发展很快,这种方法可以计算得到小分子与蛋白的结合常数[19]。
结合位点、结合位置、作用力类型等。
每一种方法都有自身的优点和局限性,为了更好更准确的研究需要把各种分析方法综合起来运用,不断地发展完善。
2实验部分
2.1药品试剂与仪器设备
2.1.1药品试剂
表1药品试剂的规格及来源
名称分子式相对分子质量(g)规格来源
硫酸锰MnSO4.H2O169A.R.开封化学试剂总厂
硫酸镍NiSO4.6H2O286.86A.R.天津市富禄化工试剂厂
木犀草素C15H10O6286.63A.R.中国药品生物制品检定所牛血清白蛋白_65000A.R.开封化学试剂总厂
三羟甲基氨基甲烷C4H11NO3121.14A.R.西安化学试剂厂
盐酸HCl36.5A.R.西安化学试剂厂
2.1.2仪器设备
RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司);UV-8453紫外分光光度计(日本日立公司);HA-180MF电子分析天平(日本日立公司);TB-85型恒温水浴(日本岛津公司)。
2.2实验步骤
称取1.212g三羟甲基氨基甲烷溶解后配置成100ml0.1ml/L的溶液;称取0.0657gNiSO4.6H2O溶解,配置成25ml0.01ml/L的溶液;称取0.0423gMnSO4.H2O溶解,配置成25ml0.01ml/L的溶液。
.取0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液50ml,加0.1mol/L盐酸溶液42.0mL,混匀加水稀释至100mL,得到的溶液为pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液。
取16个10ml的比色管对其进行编号,分别向所有试管中加入1.0×10-4mol/LBSA0.2ml,然后每4个试管为一组,给每一组中的4个试管分别加入一定量1.0×10-4mol/L的木犀草素,然后在试管中分别加入一定量1.0×10-3mol/LMnSO4(或NiSO4),最后向每一个试管中加入2mLPH值为7.40的Tris-HCl缓冲溶液2ml,用蒸馏水定容到10ml,静置30min。
用紫外分光光度计在波长200~600nm进行扫描,绘制出紫外光谱图。
在室温295K下,用荧光分光光度计在波长300~700nm范围内进行扫描发射光谱,同时在波长235~700nm和280~700nm范围内分别做同步荧光,然后分别在温度288K、296K、303K、310K、317K下扫描发射光谱,绘制出一系光谱图。
3结果与讨论
3.1木犀草素对BSA的猝灭作用
3.1.1猝灭光谱
按照上面所述的实验方法分别研究了288K、296K、303K、310K、317K温度下,在不同浓度下木犀草素对BSA的荧光猝灭光谱。
图1是295K时的猝灭光谱。
从图1可以看到,随着木犀草素浓度的逐渐增加BSA的吸收峰逐渐降低。
这是因为牛血清蛋白质中有酪氨酸和色氨酸,使的蛋白质具有内源荧光,令BSA的量固定不变,使木犀草素的浓度逐渐增加时,BSA与木犀草素的相互作用会使BSA内源荧光强度产生有规律的猝灭现象。
1:
BSA;2:
BSA+1.0木犀草素;3:
BSA+2.0木犀草素;4:
BSA+3.0木犀草素
图1310K下木犀草素与BSA相互作用的猝灭光谱图
3.1.2测定结合常数以及猝灭机理
BSA的荧光猝灭有动态猝灭、静态猝灭两种。
动态猝灭是荧光物质的激发态分子的与猝灭剂之间相互作用的过程,使处于激发态的分子返回基态的过程。
动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程:
F0/F=1+KSV[Q]=1+Kq0[Q]
式中,F0和F分别是不存在和存在猝灭剂时蛋白质的荧光强度,[Q]是猝灭剂的平衡浓度,KSV是Stern-Volmer猝灭常数,Kq为双分子猝灭速率常数,0是没有猝灭剂的时候测的光寿命。
根据有猝灭剂与没有猝灭剂时的荧光寿命不同,Stern-Volmer方程式的另一种表达形式为:
0/=1+KSV[Q]
0和分别表示没有猝灭剂存在于有猝灭剂存在下所测得的荧光寿命。
静态猝灭与动态猝灭所得的关系式相似,只有静态猝灭的情况下能用络合物形成常数来代替猝灭常数。
相关数据如表2所示:
表2木犀草素与BSA相互作用的Stern-Volmer方程方程
288F0/F-1=3.3869[Q]+0.00153.3869
296F0/F-1=3.1267[Q]+0.03243.1267
303F0/F-1=2.8718[Q]+0.01552.8718
310F0/F-1=2.6857[Q]+0.02232.6857
317F0/F-1=2.4204[Q]+0.03562.4204
一般情况下,各类猝灭剂对生物大分子的Kp(最大扩散碰撞猝灭速率常数)不大于2.0×1010moL.L-1.s-1,由上图看出,在五个不同的温度下,Kv随着温度的升高而减小,且Kp的数量级为1013,恒大于2.0×1010mol.L-1.s-1,综合以上结果,木犀草素对BSA的荧光猝灭常数Kp比扩散控制常数大,所以此猝灭不是动态猝灭,而属于静态猝灭。
3.1.3求取结合常数Kb及结合位点n
根据公式:
Log[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]可以求出小分子与大分子的结合常数Kb和结合位点n。
根据上述公式分别求出在288K、296K、303K、310K、317K下木犀草素与BSA相互作用的Kb和n,见表3.
表3木犀草素与BSA相互作用的Kb和n
TLinearequationsRKbn
/K/(L.moL-1)
288Log[(F0-F)/F]=0.7366log[Q]+4.28100.99870.19×10-50.7365
296Log[(F0-F)/F]=0.6443log[Q]+3.83120.99880.68×10-40.6443
303Log[(F0-F)/F]=0.5894log[Q]+3.52810.99830.34×10-40.5894
310Log[(F0-F)/F]=0.5648log[Q]+3.40000.99990.25×10-40.5648
317Log[(F0-F)/F]=0.5553log[Q]+3.27790.99990.19×10-40.5553
3.1.4研究作用力类型及热力学性质
分子间作用力有静电引力、疏水作用力、氢键、范德华力等,温度变化幅度微小时ΔH可看做是不变的,利用热力学公式计算出ΔH、ΔS、ΔG,由ΔG<0可知木犀草素与BSA的相互作用是自发完成的,又由于ΔH<0且ΔS>0,可以推断出木犀草素与BSA之间相互作用主要以静电引力为主,但是由于木犀草素是多羟基疏水化合物,所以应该还有疏水作用力和氢键的存在。
3.1.5同步荧光光谱
a:
Δλ=15nmb:
Δλ=60nm
1:
BSA2:
BSA+1.0木犀草素3:
BSA+2.0木犀草素4:
BSA+3.0木犀草素
图2同步荧光光谱图
同步荧光光谱可以研究蛋白质的构象变化,因为在Δλ=15nm所发的荧光只能是蛋白质中酪氨酸残基显示的,在Δλ=60nm所发的荧光只能是蛋白质中色氨酸残基显示的,由图2可以看出Δλ=15nm、Δλ=60nm的同步荧光都发生了猝灭现象,而且酪氨酸残基光谱峰发生了蓝移,这说明酪氨酸残基的微环境中亲水性降低,疏水性增加,色氨酸的谱峰位置没有太大的变化,说明色氨酸对BSA的微环境影响不大。
色氨酸残基的猝灭明显比酪氨酸残基的严重,所以结合位点接近于色氨酸残基。
3.2Mn2+对木犀草素与BSA相互作用的影响
3.2.1荧光猝灭光谱图
1:
BSA;2:
BSA+Mn2+;3:
BSA+药物;4:
BSA+药物+Mn2+
图3Mn2+对木犀草素与BSA相互作用荧光光谱图
根据设计的实验方法分别研究了288K、296K、303K、310K、317K温度下,有Mn2+参与时在不同浓度下木犀草素对BSA的荧光猝灭光谱。
图3是2
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