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丹皮酚偶氮类化合物抑菌活性的初步研究生物科学大学论文
丹皮酚偶氮类化合物抑菌活性的初步研究
摘要
一直以来,研究和开发高效,低毒,广谱的抑菌剂用于植物病害的防治是众多科研工作者的目标。
丹皮酚作为来源于植物的天然活性物质,因其具有广谱的抑菌活性而受到广泛关注,已有的研究表明,其衍生物也有着不同的抑菌活性。
本文选取丹皮酚及10种丹皮酚偶氮类化合物,采用抑菌圈生长速率法,研究了其对玉米大斑病菌Exserohilumturcicum(Pass)LeonardetSuggs、马铃薯早疫病菌Alternariadauci(Kuhn)GrovesetSkolkof.sp、番茄叶霉病菌Cladosporiumfulvum和番茄灰霉病菌Botrytiscinerea四种病原真菌的抑菌活性。
实验结果表明,10种丹皮酚偶氮类化合物在浓度为0.05mg/mL时对四种病原真菌的抑菌率均在58.23%以上;丹皮酚偶氮类化合物抑菌效果明显好于母体化合物丹皮酚,尤其是化合物3d和3j对四种病原真菌具有较高的抑菌活性,其抑菌率都在96.77%以上。
本研究的开展为新型植物源抑菌剂的开发奠定了一定的理论基础。
关键词:
丹皮酚,偶氮类化合物,菌丝生长速率,抑菌活性
APRELIMINARYSTUDYONANTIFUNGALACTIVITYOFPAEONOLAZOCOMPOUNDS
ABSTRACT
Researchandexploitationhighefficient,lowtoxicity,broad-spectrumantifungalpesticides,andusedfortheplantdiseasepreventionandcontrolisalwaysthekeyprobleminagriculture.Paeonolwasseparatedfromplants,anditiswidelyattentionbecauseofitsspectrumofantimicrobialactivity.Recentstudydemonstratesthethatpaeonolderivativesalsohavedifferentantifungalactivity.Thispaperinvestigates Theinhibitoryeffectsof tenkindsofpaeonolazocompoundsand on pathogenicfungusExserohilumturcicum(Pass)LeonardetSuggs,Alternariadauci(Kuhn)GrovesetSkolkof.Sp,CladosporiumfulvumangBotrytiscinereaweretestedbyadoptingmyceliumgrowthratemethod.Theresultsshowthatwhentheconcentrationis0.05mg/ml,paeonolazocompoundsantifungalrateover58.23%,andthe10kindsofazocompoundswerestrongerthanthatofpaeonol.Andinparticulartheantifungalratesofcompounds3dand3jaremorethan96.77%.Thisstudywillprovidetheforthedevelopmentofnewplant-basedantifungalpesticides.
Keywords:
paeonol,azocompound,mycelialgrowthrate,antifungalactivity
目录
第1章绪论4
1.1丹皮酚简介和活性4
1.1.1丹皮酚简介4
1.1.2丹皮酚活性4
1.2偶氮类化合物简介和活性5
1.2.1偶氮类化合物简介5
1.2.2偶氮类化合物活性5
1.3研究目的和意义5
第2章实验材料和方法7
2.1实验材料7
2.1.1供试菌种7
2.1.2供试化合物7
2.2主要仪器设备和试剂8
2.2.1仪器与设备8
2.2.2试剂9
2.3实验方法和步骤9
2.3.1实验方法9
2.3.2实验步骤9
第3章结果与分析11
3.1抑菌活性结果11
3.2抑菌活性结果分析15
3.3结构与活性关系分析15
第4章17
4.1结论17
4.2讨论17
致谢19
参考文献20
第1章绪论
1.1丹皮酚简介和活性
1.1.1丹皮酚简介
丹皮酚(Paeonol),又称为牡丹酚或芍药醇。
分子式为C9H10O3,相对分子质量为166.18,化学式为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮,是从毛茛科植物牡丹根皮和萝科植物徐长卿Pyc-nostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草中分离得到的主要活性物质[1]。
牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr)是芍药科、芍药属,多年生的小灌木[2]。
牡丹是我国特有的木本花卉,在河北柏山、陕西汉中、河南洛阳、山东荷泽、安徽铜陵等地均有大面积种植,有调查显示,我国牡丹的种植面积已超过100万亩。
我国有着大量的牡丹植物资源,是丹皮酚的自然资源宝库,而且,目前对丹皮酚也有了多种提取技术,并且可以得到较高的提取率,现在通常用水蒸汽蒸馏法、溶剂法、02超临界流体萃取法等方法分离提取丹皮酚[3-5];同时,还有文献报道了5种丹皮酚人工合成途径,例如汪秋安以间苯二酚和冰醋酸作为原料,通过进行傅-克酰基化反应,甲基化反应得到丹皮酚,产率可达到84%[6];Ramesh等人通过微波辐射,以2,4-二甲氧基苯乙酮为原料,合成丹皮酚,产率为75%[7]。
1.1.2丹皮酚活性
牡丹皮始载于《神农本草经》,是一味常用的药材,其性微寒,味略苦。
常用来活血化癖,清热凉血。
临床药理学方面的研究表明丹皮具有非常广的药理活性,例如在抗菌、抗炎、抗病毒、还有对心血管系统、中枢神经系统等都有一定的作用。
在临床上牡丹经常用来对多种顽固皮肤病、跌打损伤等病症的治疗,是一味重要中药。
由于丹皮酚结构简单,结构式见图1.1,却有明显的生物活性,受到国内外科研人员的广泛关注,同时因为易挥发、水溶性差等缺点在应用方面受到限制[8]。
目前,对丹皮酚有着非常广泛的研究和应用,在对其结构修饰和改造也有大量的研究和相关文献,包括合成了一系列的丹皮酚衍生物,并对其进行相关活性的研究。
但是对丹皮酚的研究主要集中在临床应用和日化产品方面,还未见到关于丹皮酚偶氮类化合物抑菌活性的相关文献。
图1.1丹皮酚结构式
1.2偶氮类化合物简介和活性
1.2.1偶氮类化合物简介
偶氮类化合物(AZO)是指偶氮基─N=N─与两个基团相连接的一类化合物,化学通式为R′─N=N─R。
目前主要通过重氮盐的偶联反应途径来合成偶氮类化合物,例如方治坤等人用多钼酸氧化合成偶氮苯并噻唑[9]。
现在偶氮类化合物被广泛应用于化学染料,化学指示剂,食品着色剂等方面。
1.2.2偶氮类化合物活性
目前大量研究表明一些具有生物活性的物质通过偶联反应生成偶氮类化合物后,会具有更好的生物活性。
例如曹阳等人对丹皮酚与对氨基苯胂酸进行偶联反应,合成了丹皮酚偶氮化合物,并采用合成的丹皮酚偶氮化合物对人体肝癌细胞株(HepG2细胞)进行了抑制活性试验,研究表明其合成化合物作用明显强于母体化合物丹皮酚和阿散酸的单独作用[10]。
吕春霞等人以8-羟基喹啉为母体化合物合成了8种偶氮类化合物,并采用抑制菌丝生长速率法对所合成的一系列偶氮化合物进行了抑菌活性测试。
研究结果表明在供试化合物浓度为0.05mg/ml时,8种供试化合物中有2种具有良好的抑制活性[11]。
1.3研究目的和意义
我国作为一个农业大国和人口大国,要用全世界约7%的耕地和约6%的淡水资源来供养全世界约22%的人口。
在现代农业的发展中农药的使用是维持农作物高产的重要因素之一,化学农药由于价格低廉、抑菌杀菌效果好而被广泛使用,有统计显示,全世界每年使用近200万吨农药,其中我国就占了占33.4万吨[12-13]。
随着近年来化学农药在农业中的大规模使用,化学农药不仅对环境造成了严重的破坏,而且严重的危险到了人类和许多动物的健康。
同时由于化学农药的长期使用,许多生物都产生了不同程度的抗药性,人们只能增加农药的使用频率和剂量来达到杀菌效果,从而形成了使用量和使用频率逐年增加的恶性循环。
近年来研究报道表明众多的化学农药对人体有着致畸、致癌的副作用,所以目前科研学者把研究方向转向无毒或低毒的生物源杀菌剂的研发和利用上[14]。
因此研发一种低成本,低毒,高效,低残留和易降解的生物源农药对农业发展、人类健康和环境保护有着重要的意义。
本研究采用的是天然产物丹皮酚及其丹皮酚偶氮类化合物,与化学农药相比生物源药物一般具有无毒或毒性小、易降解、对环境更友好、在人体和动物体内无富集等优点,但是由于天然提取药物一般具有稳定性差、提取成本高、成分复杂、检测难等原因而使其使用受到限制。
本文对丹皮酚和丹皮酚偶氮类化合物的活性进行研究,一方面可以探究这10种化合物的抑菌活性,另一方面为新型植物源抑菌药剂的研发奠定了一定的理论基础,而且为深入研究其构效与抑菌活性的关系,确定药效最佳的化学结构模型,为发现活性更佳、更有应用开发前景的抑菌类植物源药物。
第2章实验材料和方法
2.1实验材料
2.1.1供试菌种
4种供试病植物原真菌见表2.1,病原真菌由北方民族大学实验室课题小组提供。
表2.1供试菌种名称
编号
供试菌株中文名
供试菌株拉丁文名
A
玉米大斑病菌
Exserohilumturcicum(Pass.)LeonardetSuggs
B
马铃薯早疫病菌
Alternariadauci(Kuhn)GrovesetSkolkof.sp
C
番茄叶霉病菌
Cladosporiumfulvum
D
番茄灰霉病菌
Botrytiscinerea
2.1.2供试化合物
供试化合物由北方民族大学实验室课题小组提供,通过丹皮酚与2,4-二硝基苯胺,邻甲氧基苯胺,对甲苯胺,对甲氧基苯胺,3-硝基苯胺,对硝基苯胺,2-硝基苯胺,4-溴苯胺,苯胺,邻氯苯胺,邻甲苯胺,对氯苯胺的偶联反应,合成10种丹皮酚偶氮类化合物,偶联反应路线见图2.1,10种供试化合物3a-3j的分子结构见图2.2。
图2.1偶氮类化合物合成路线图
目标产物3a目标产物3b目标产物3c
目标产物3d目标产物3e目标产物3f
目标产物3g目标产物3h目标产物3i
目标产物3j
图2.210种供试化合物(3a-3j)的化学机构
2.2主要仪器设备和试剂
2.2.1仪器与设备
表2.2实验所用仪器与设备
序号
仪器名称
型号
生产厂家
1
电炉
EH20Aplus
北京伯泰科仪器有限公司
2
生化培养箱
SHP-250
上海精宏实验设备有限公司
3
微生物洁净工作台
SW-CG-1CV
苏净集团安泰公司
4
冰箱
BCD-265F
海尔公司
5
电子天平
BS2000S
北京赛多利斯天平有限公司
6
立式压力蒸汽灭菌器
XXQ-LS-50SⅡ
上海博迅实业有限公司医疗公司
2.2.2试剂
丙酮,葡萄糖,琼脂粉,乙醇等(以上试剂均为分析纯)
2.3实验方法和步骤
本实验流程图见图2.3。
PDA培养基的制备
10种丹皮酚偶氮类化合物的准备
四种供试菌株活化
配置丙酮药液和制备带药培养基
接菌并于(27±1)℃培养3天
1.抑菌率的计算
2.抑菌活性分析
图2.3抑菌实验流程图
2.3.1实验方法
目前,化合物抑菌活性测定的方法主要有两种:
生长速率法和孢子萌发法,本研究采用了菌丝生长速率法,生长速率法又称为培养基加药法。
是将供试药剂溶液与45℃-50℃的培养基混合均匀后制作平板,然后接上供试菌种,用含供试药剂的培养基培养病原菌,通过病原菌的菌丝生长速率来研究供试药剂的抑菌活性[15-20]。
2.3.2实验步骤
(1)PDA培养基的制备:
(去皮的马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml),制作方法:
本实验需要约3000ml培养基,故称取600g去皮马铃薯并切成小块,在铁锅内先加3000ml蒸馏水,并用记号笔标记水的液面,待水煮沸后放入已经切好的马铃薯小块,待再次煮沸后计时30分钟,然后用4层纱布滤除马铃薯块,滤液仍倒入铁锅内,加适量蒸馏水使其液面仍保持原标记处,待煮沸后加入60g琼脂,使琼脂溶化后再加60g葡萄糖,并用玻璃棒不停地搅动,以免糊底,直到溶化后再次补足水量。
充分溶解后趁热用4层纱布过滤,然后用分装在250ml的锥形瓶中并封口。
(2)培养基的湿热灭菌:
高压蒸汽灭菌锅先加蒸馏水至环形管刻度线,放上铝锅,锅内摆放需要灭菌的器材(其中包括盛有培养基的锥形瓶、洗净包好的烧杯、装有蒸馏水的锥形瓶等)。
盖上锅盖,关闭安全阀门并检查密封,打开放气阀,打开电源并观察显示器显示的水位,设置高压蒸汽灭菌锅参数,121℃、0.11MP灭菌30分钟,待冷空气排空之后关闭排气阀,灭菌结束后打开放气阀,注意控制排气速度,过快容易使锥形瓶内的培养基飞溅,待高压蒸汽灭菌锅内气压降到0MP后取出灭菌器材并放到无菌操作台备用。
(3)超净工作台的灭菌:
实验前将接种环、4mm的打孔器、镊子和酒精灯放入超净工作台。
每次使用超净工作台之前,都应该提前30分钟打开紫外灯。
使用时关闭紫外灯,开启日光灯,并用75%的酒精擦拭消毒手和工作台面。
实验结束后,用75%的酒精擦擦拭手和工作台面,关闭日光灯,重新开启紫外灯照射20分钟。
(4)菌种准备:
在超净工作台内用90mm的培养皿倒入约12mlPDA培养基,待培养基冷却凝固后,将4种供试病原真菌接入培养皿的中心位置,标记接菌时间和菌名编号,(27±1)℃培养3天后,4℃冰箱中保存,然后在试验前3天再接种一次,在(27±1)℃的条件下培养备用。
(5)药液准备:
将精确度为0.01mg的电子天平调平校准后,分别称量11.25mg的丹皮酚和10种供试药剂并分别溶于5ml丙酮中,按照供试药剂编号备用。
(6)带药培养基的制备:
参考刘小红等人[21]的菌丝生长速率法测定的配制方法。
先用量筒量取225ml蒸馏水于锥形瓶中,用记号笔标记液面高度,之后将PDA培养基分装在锥形瓶中,并定容至225ml后封口并灭菌,将灭菌后的培养基放在无菌操作台,待温度降到45℃-50℃后在每瓶中加入准备好的5ml药液使其混合均匀,并按药液编号对应编号,然后趁热倒入直径为90mm的培养皿中制成薄厚均匀的平板备用。
(7)接菌与培养:
在超净工作台内,将备用的供试菌种在同一半径下用4mm的打孔器打出一定数量的菌饼。
用接种环小心将菌饼置于带要培养皿中心,菌丝一面向下,每种药液的培养基分别接4个不同的菌,每皿1个菌饼,每个处理设3个重复,每个培养皿加盖后标记接菌的编号、带药培养基编号和接菌时间。
置于(27±1)℃的恒温培养箱中倒置培养3天后取出培养皿,观察菌丝生长情况,并用游标卡尺测量菌落直径,须十字交叉量取两次,取其平均数。
第3章结果与分析
3.1抑菌活性结果
化合物丹皮酚、3a-3j对玉米大斑病菌、马铃薯早疫病菌、番茄叶霉病菌和番茄灰霉病菌这4种供试病原真菌的生长抑制作用实验结果见表3-1;图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5和图3-6。
抑菌率由公式2.1计算所得。
(处理组菌落生长直径=菌落两次直径平均数–4mm)
公式2.1抑菌率计算公式
表3.1化合物的抑菌活性
化合物
抑菌率(%)
玉米大斑病菌
马铃薯早疫病菌
番茄叶霉病菌
番茄灰霉病菌
Paeonol
14.11±(0.76)
50.65±(5.04)
—
39.31±(2.72)
3a
74.84±(12.37)
83.58±(2.28)
99.18±(0.55)
98.66±(1.27)
3b
70.81±(4.01)
76.85±(2.50)
78.35±(12.72)
93.72±(1.07)
3c
72.34±(3.34)
58.23±(8.16)
65.44±(6.29)
92.54±(1.51)
3d
97.39±(2.39)
98.67±(0.67)
96.77±(1.63)
97.99±(0.06)
3e
87.13±(2.90)
88.92±(4.57)
99.41±(0.61)
99.74±(0.15)
3f
82.03±(3.95)
68.35±(3.20)
82.22±(15.33)
93.91±(2.37)
3g
83.56±(2.16)
66.23±(5.32)
98.77±(1.46)
92.88±(2.25)
3h
84.49±(4.99)
78.50±(4.23)
95.99±(2.06)
98.20±(0.43)
3i
85.55±(7.23)
73.51±(2.42)
91.19±(2.15)
96.85±(1.49)
3j
98.26±(0.52)
96.02±(0.39)
99.75±(0.08)
98.37±(0.38)
CK
0
0
0
0
(注:
表3.1中括号内的内容为标准方差,通过Excel计算所得;化合物浓度为0.05mg/ml;—表示该组污染)
图3.1化合物3d对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-4对应化合物3d;A-CK为空白对照)
图3.2化合物3e对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-5对应化合物3e;A-CK为空白对照)
图3.3化合物3f对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-4对应化合物3f;A-CK为空白对照)
图3.4化合物3g对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-7对应化合物3g;A-CK为空白对照)
图3.5化合物3h对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-8对应化合物3h;A-CK为空白对照)
图3.6化合物3j对玉米大斑病菌的抑菌活性图(A-10对应化合物3j;A-CK为空白对照)
3.2抑菌活性结果分析
从表3-1中可以看出,3a-3j10种供试化合物对玉米大斑病菌、马铃薯早疫病菌、番茄叶霉病菌和番茄灰霉病菌四种病原真菌的抑菌率均在58.23%以上,母体丹皮酚对玉米大斑病菌的抑菌率为14.11%、对马铃薯早疫病菌的抑菌率为50.65%、对番茄灰霉病菌的抑菌率为39.31%,其抑菌活性明显都低于供试时化合物3a-3j的抑菌活性。
10种丹皮酚偶氮类化合物中对玉米大斑病菌抑制活性最好的是化合物3j(98.26%),对马铃薯早疫病菌抑制活性最好的是化合物3d(98.67%),对番茄叶霉病菌抑制活性最好的是化合物3j(99.75%),对番茄灰霉病菌抑制活性最好的是化合物3e(99.74%)。
3a-3d10种供试化合物中3d和3j对四种病原真菌都有较好的抑菌活性,化合物3d玉米大斑病菌抑制活性率为97.39%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率为98.67%,对番茄叶霉病菌的抑菌率为96.77%,对番茄灰霉病菌的抑菌率为97.99%;化合物3j玉米大斑病菌抑制活性率为98.26%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率为96.02%,对番茄叶霉病菌的抑菌率为99.75%,对番茄灰霉病菌的抑菌率为98.37%。
3a、3b、3c、3e、3f、3g、3h、3i8种供试化合物因供试菌种的不同,其抑菌活性差异较大。
例如,供试化合物3g对番茄叶霉病菌的抑菌率为98.77%,但对马铃薯早疫病菌的抑菌率仅为66.23%。
综上所述,10种丹皮酚偶氮类化合物的抑菌活性明显高于母体丹皮酚的抑菌活性,其中3d和3j两种供试化合物对四种供试病原真菌都具有非常高的抑菌活性。
从图2.2和表3.1对照可以明显看出母体丹皮酚与3a-3j10种供试化合物抑菌活性的差异与其化学结构有关,3a-3j10种供试化合物的抑菌活性与构效关系分析见图3.7。
3a-3j10种供试化合物的抑
图3.73a-3j10种化合物结构通式
菌活性明显高于母体丹皮酚的抑菌活性,说明偶氮双键与取代基团类型对该化合物的抑菌活性有重要影响。
化合物3a和3f抑菌活性的差异是因为取代基团甲基的位置不同,当R1位置上为甲基时,即化合物3a对玉米大斑病菌的抑菌率为74.84%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率为83.58%,对番茄叶霉病菌的抑菌率为99.18%,对番茄灰霉病菌的抑菌率为98.66%;当R3位置上为甲基时,即化合物3f对玉米大斑病菌的抑菌率为82.03%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率为68.35%,对番茄叶霉病菌的抑菌率为82.22%,对番茄灰霉病菌的抑菌率为93.91%;化合物3a和3f对番茄灰霉病菌的抑菌率差异约5%,对番茄叶霉病菌的抑菌率差异约17%,对玉米大斑病菌的抑菌率差异约8%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率差异约15%,化合物3a和化合物3f的抑菌活性差异较小,说明该化合物的抑菌活性受甲基的位置效应影响较小。
化合物3b、3d、3e和3j抑菌活性的差异是因为硝基的位置和数量不同,4种化合物的综合抑菌能力依次是3j>3d>3e>3b,而且化合物3j和化合物3d在10种供试化合物中的抑菌活性最高,说明在该化合物的R1和R3位置上同时存在两个硝基时,或者该化合物的R2位置上是硝基都可以增加抑菌活性,而在R1或R3位置上的单个硝基基团则对该化合物的抑菌活性影响较小;化合物3g的氯基在R3位置上,化合物3h的氯基在R1位置上,而化合物3g和3h的抑菌活性差异较小,说明该化合物受氯基基团的位置上效应影响较小。
综上所述,通过化合物3a-3j的抑菌活性比较,以及构效分析可知,3a-3j10种丹皮酚偶氮类化合物对四种病原真菌的抑菌活性都明显高于丹皮酚对四种病原真菌的抑菌活性,与偶氮双键的存在和取代基团的类型有重要关系,这与偶氮类化合物普遍具有抑菌活性的结果一致;化合物中硝基对抑菌活性的影响大于其他四种基团对该化合物抑菌活性的影响,并且当R1和R3位置上同时是硝基时,或者R2位置上是硝基时该化合物对四种病原真菌具有最佳的抑菌活性,其整体抑菌率高于99.75%,而在R1或R3位置上是硝基时该化合物的抑菌率则相对较低。
取代基团甲基、甲氧基、醚基和氯基的不同或位置不同也会使其抑菌活性不同,但是对化合物整体的抑菌活性影响较小,只会造成对个别供试真菌的抑菌活性差异略大。
当R3位置上为氯基时,即化合物3g对玉米大斑病菌的抑菌率为83.56%,对马铃薯早疫病菌的抑菌率为
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