分子生物学课件重点整理朱玉贤.docx
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分子生物学课件重点整理朱玉贤
四、DNA的修复
DNA修复系统
功能
错配修复
恢复错配
碱基切除修复
切除突变的碱基
核甘酸切除修复
修复被破坏的DNA
DNA直接修复
修复嘧啶二体或甲基化DNA
SOS系统
DNA的修复,导致变异
1、错配修复(mismatchrepair)
●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化
●甲基化紧随在DNA复制之后进行(几秒种后至几分钟内)
●根据复制叉上DNA甲基化程度,切除尚未甲基化的子链上的错配碱基
2、碱基切除修复excisionrepair
所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶,它能特意切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键,在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点,统称为AP位点。
一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺,然后改变配对性质,造成氨基转换突变
*腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对
*鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对
*胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对
3、核苷酸切除修复
1)通过特异的核酸内切酶识别损伤部位
2)由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸
3)DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链
4)DNA连接酶将切口补平
4、DNA的直接修复
在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体
甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤,防止G-T配对
SOS反应(SOSresponse):
是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下,细胞为求生存而产生的一种应急措施。
*包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。
细胞癌变也与SOS反应有关。
两个作用
(1)DNA的修复;
(2)产生变异
五、DNA的转座
DNA的转座或叫移位(transposition):
由可移位因子(transposableelement)介导的遗传物质重排现象。
转座子(transposonTn):
存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
已经发现“转座”这一命名并不十分准确,因为在转座过程中,可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上,在新位点上出现的仅仅是它的拷贝。
因此,转座有别于同源重组,它依赖于DNA复制。
原核生物转座子的类型:
1、插入序列(IS)
IS是最简单的转座子,不含有任何宿主基因,它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。
2、复合转座子(compositetransposon)
复合转座子是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子,其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列
3、TnA家族
⏹TnA家族没有IS序列、体积庞大(5000bp以上)、带有3个基因,其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR),另两个则是转座作用所必须的。
(三)转座作用的机制
⏹转座时发生的插入作用的普遍特征,是受体分子中有一段很短的(3~l2bp)、被称为靶序列的DNA会被复制,使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
⏹对于一个特定的转座子来说,它所复制的靶序列长度是一样的,如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列,而Tn3两端总有5bp的靶序列。
⏹靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性DNA末端。
(三)转座作用的遗传学效应p63
(1)转座引起插入突变
(2)转座产生新的基因(3)转座产生的染色体畸变(4)转座引起的生物进化
反转录转座子(retrotransposon):
指通过RNA为中介,反转录成DNA后进行转座的可动元件。
第三章生物信息的传递(上)——从DNA到RNA
转录(transcription):
生物体以DNA为模板合成RNA的过程。
参与转录的物质
原料:
NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)
模板:
DNA
酶:
RNA聚合酶
其他蛋白质因子
RNA合成方向:
5'到3'
转录的不对称性:
在RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的不对称性。
与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链;将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。
DNA分子上转录出RNA的区段,称为结构基因。
转录单元(transcriptionunit)一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。
二、参与转录起始的关键酶与元件
(一)RNA聚合酶
●原核生物RNA聚合酶(大肠杆菌为例)---全酶=核心酶+σ因子
亚基
基因
相对分子量
亚基数
组分
功能
α
rpoA
36500
2
核心酶
核心酶组装,
启动子识别
β
rpoB
151000
1
核心酶
β和β'共同形成
RNA合成的活性中心
β'
rpoC
155000
1
核心酶
ω
?
11000(需查)
1
核心酶
?
σ
rpoD
70000
1
σ因子
存在多种σ因子,
用于识别不同的启动子
真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较
酶
位置
转录产物
相对活性
对α-鹅膏蕈碱的敏感性
RNA聚合酶Ⅰ
核仁
rRNA
50-70%
不敏感
RNA聚合酶Ⅱ
核质
hnRNA
20-40%
敏感
RNA聚合酶Ⅲ
核质
tRNA
约10%
存在物种特异性
RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别
RNA聚合酶
DNA聚合酶
大小(M)
大,4.8×105dol
小,1.09×105dol
引物
无
有
产物
较短,游离
较长,与模板以氢键相连
作用方式
一条链的某一段
两条链同时进行
外切酶活性
无
5’3’,3’5’
校对合成能力
无
有
修复能力
无
有
(二)启动子(promoter)
启动子定义:
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
TATA区:
酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开)
TTGACA区:
提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。
真核生物启动子的结构
核心启动子(corepromoter)
●定义:
指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区
●作用:
选择正确的转录起始位点,保证精确起始
2、上游启动子元件
●包括CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等
●作用:
控制转录起始频率。
(三)转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。
(原核)
三、转录的基本过程
1、起始位点的识别:
RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。
RNA聚合酶全酶
(2)与模板结合
2、转录起始
①RNA聚合酶全酶(a2s¢bb)与模板结合
•DNA双链解开
•在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成转录起始复合物
5¢-pppG-OH+NTP®5¢-pppGpN-OH3¢+ppi
转录起始复合物:
RNApol(a2s¢bb)-DNA-pppGpN-OH3¢
3、RNA链的延伸
●亚基脱落,RNA–pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛,沿着DNA模板前移;
●在核心酶作用下,NTP不断聚合,RNA链不断延长。
注意:
9个核苷酸以前还在启动子区,容易脱落,一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区,转录正式进入眼神阶段。
4、转录终止
终止子(terminator):
位于基因的末端,在转录终止点之前有一段回文序列(反向重复序列)约6-20bp。
真核生物终止:
由一段特定序列5′-AATAAA-3′和回文序列(反向重复序列)组成。
分为两类:
●强终止子-内部终止子:
不依赖Rho(ρ)因子的终止。
●弱终止子-需要ρ因子(rhofactor),又称为ρ依赖性终止子(Rho-dependentterminator)
不依赖r因子的终止
当RNA链延伸到转录终止位点时,RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键,RNA-DNA杂合物分离,转录泡瓦解,DNA恢复成双链状态,而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来,这就是转录的终止。
终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区,RNA形成发夹结构;
在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列,RNA的3’端为寡聚U
发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。
依赖r因子的终止
r因子:
六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来,从而终止转录。
(二)、真核生物的转录过程
1.转录起始
真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化,转录起始时,RNA-pol不直接结合模板,其起始过程比原核生物复杂。
(1).转录起始前的上游区段
•顺式作用元件(cis-actingelement):
影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。
例:
启动子、增强子、弱化子等
•增强子:
在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。
但不是启动子的一部分。
特点:
1.远距离效应;2.无方向性;3.顺式调节;4.无物种和基因的特异性;5.具有组织特异性;6.有相位性;7.有的增强子可以对外部信号产生反应。
(2).转录因子:
能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。
反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。
参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH
(3)转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)
真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合,而需依靠众多的转录因子。
(4)模板理论(piecingtheory)
一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。
转录因子之间互相结合,生成有活性、有专一性的复合物,再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。
2.转录延伸
真核生物转录延长过程与原核生物大致相似,但因有核膜相隔,没有转录与翻译同步的现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。
3.转录终止——和转录后修饰密切相关。
四、转录后加工
5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑
1、在5’端加帽
5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp)。
mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap)。
帽子结构功能:
①能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;
②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端,以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳定。
2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA:
★准确切割。
。
★加poly(A)
多聚腺苷酸尾巴功能:
提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
3、RNA的剪接
生物体内内含子的主要类型:
U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子Ⅲ类内含子
参与RNA剪接的物质:
snRNA(核内小分子RNA)、snRNP(与snRNA结合的核蛋白)、核内RNA(U1、U2、U4、U5、U6)
4、RNA的编辑
*编辑(editing)是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。
五、原核生物与真核生物mRNA的特征比较
1、原核生物mRNA的特征
●半衰期短
●多以多顺反子的形式存在
单顺反子mRNA:
只编码一个蛋白质的mRNA。
多顺反子mRNA:
编码多个蛋白质的mRNA。
Z:
β-半乳糖苷酶Y:
透过酶A:
乙酰基转移酶
ZYA为结构基因
●5’端无“帽子”结构,3’端没有或只有较短的poly(A)结构。
●SD序列:
原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区。
mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
P85
2、真核生物mRNA的特征
“基因”的分子生物学定义:
产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。
●5’端存在“帽子”结构
●多数mRNA3’端具有poly(A)尾巴(组蛋白除外)
●以单顺反子的形式存在
六、RNA合成与DNA合成异同点
相同点:
1、都以DNA链作为模板
2、合成的方向均为5’→3’
3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3’,5’-磷酸二酯键,使核苷酸链延长。
不同点:
复制
转录
模板
两条链均复制
模板链转录
(不对称转录)
原料
dNTP
NTP
酶
DNA聚合酶
RNA聚合酶
产物
子代双链DNA
(半保留复制)
mRNA,tRNA,rRNA
配对
A-T;G-C
A-U;T-A;G-C
引物
RNA引物
无
第四章生物信息的传递(下)—从mRNA到蛋白质
翻译:
指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始,按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则,依次合成一条多肽链的过程。
蛋白质合成的场所是核糖体。
蛋白质合成的模板是mRNA
模板与氨基酸之间的接合体是tRNA
蛋白质合成的原料是20种氨基酸
一、遗传密码¡ª¡ª三联子
(一)三联子密码:
mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(tripletcoden)。
●至1966年,20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清。
(三)遗传密码的性质
1、连续性
编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读,密码间既无间断也无交叉。
基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失,可能导致框移突变(frameshiftmutation)。
从mRNA5¢端起始密码子AUG到3¢端终止密码子之间的核苷酸序列,各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链,称为开放阅读框架(openreadingframe,ORF)。
2、简并性
由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并(degeneracy),对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子(synonymouscodon)。
3、通用性与特殊性
蛋白质生物合成的整套密码,从原核生物到人类都通用。
已发现少数例外,如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。
4、摆动性
转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合,在密码子与反密码子的配对中,前两对严格遵守碱基配对原则,第三对碱基有一定的自由度,可以“摆动”,这种现象称为密码子的摆动性。
二、tRNA的结构、功能与种类
(一)tRNA的结构
1、二级结构:
三叶草形2、三级结构:
“L”形
(二)tRNA的功能
1、解读mRNA的遗传信息
2、运输的工具,运载氨基酸
tRNA有两个关键部位:
●3’端CCA:
接受氨基酸,形成氨酰-tRNA。
●与mRNA结合部位—反密码子部位
tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别,把所带氨基酸放到肽链的一定位置。
1、起始tRNA和延伸tRNA
能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA,其他tRNA统称为延伸tRNA。
真核生物:
起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met,起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。
原核生物:
起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸,起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet
2、同工tRNA
代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。
同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码,又要有某种结构上的共同性,能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别(P119)。
3、校正tRNA
无义突变校正tRNA:
可以通过改变反密码子区校正无义突变
错义突变校正tRNA:
通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上,合成正常的蛋白质。
无义突变:
在蛋白质的结构基因中,一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA),使蛋白质合成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变。
错义突变:
由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子,这种基因突变叫错义突变。
GGA(甘氨酸)AGA(精氨酸)
四、氨酰-tRNA合成酶
•AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶,它既能识别tRNA,又能识别氨基酸,对两者都具有高度的专一性。
三、核糖体的结构与功能
核糖体是由rRNA(ribosomalribonucleicacid)和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒,蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。
细菌是70s{50s\30s}哺乳动物是80s{60s\\40s}
(二)核糖体的功能:
合成蛋白质
在单个核糖体上,可化分多个功能活性中心,在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。
●mRNA结合部位——小亚基
●结合或接受AA-tRNA部位(A位)——大亚基
●结合或接受肽基tRNA的部位——大亚基
●肽基转移部位(P位)——大亚基
●形成肽键的部位(转肽酶中心)——大亚基
四、蛋白质合成的过程(生物学机制)
•氨基酸的活化
•翻译的起始
•肽链的延伸
•肽链的终止
•蛋白质前体的加工
(一)氨基酸的活化
原核生物中,起始氨基酸是:
甲酰甲硫氨酸
起始AA-tRNA是:
fMet-tRNAfMet
真核生物中,起始氨基酸是:
甲硫氨酸
起始AA-tRNA是:
Met-tRNAMet
(二)翻译的起始
原核生物(细菌)为例:
所需成分:
30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、
fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+
翻译起始因子:
IF-1、IF-2、IF-3、
翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步:
(P129)
1.核蛋白体大小亚基分离
2、30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合。
3.在IF-2和GTP的帮助下,fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合,GTP水解,释放翻译起始因子。
真核生物翻译起始的特点
●核糖体较大,为80S;
●起始因子比较多;
●mRNA5′端具有m7Gppp帽子结构
●Met-tRNAMet
●mRNA的5′端帽子结构和3′端polyA都参与形成翻译起始复合物;
真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物)
原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合,再与fMet-tRNAfMet结合,最后与50S大亚基结合。
而在真核生物中,40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合,再与模板mRNA结合,最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物(P131)。
(三)肽链的延伸
肽链延伸由许多循环组成,每加一个氨基酸就是一个循环,每个循环包括:
AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。
延伸因子(elongationfactor,EF):
原核生物:
EF-T(EF-Tu,EF-Ts)、EF-G
真核生物:
EF-1、EF-2
1、AA-tRNA与核糖体A位点的结合需要消耗GTP,并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子
2、肽键形成:
是由转肽酶/肽基转移酶催化
3、移位:
核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。
需要消耗GTP,并需EF-G延伸因子
A位点是新到来的氨酰-tRNA的结合位点。
P位点是肽酰-tRNA的结合位点。
E位点是延伸过程中释放tRNA的位点,即,去氨酰-tRNA通过E位点脱出,释放到核糖体外的胞质中。
(四)肽链的终止
RF1:
识别终止密码子UAA和UAG
终止因子RF2:
识别终止密码子UAA和UGA
RF3:
具GTP酶活性,刺激RF1和RF2活性,协助肽链的释放
真核生物只有一个终止因子(eRF)
(五)蛋白质前体的加工
1、N端fMet或Met的切除
2、二硫键的形成
3、特定氨基酸的修饰
磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化
4、切除新生肽链中非功能片段
(六)蛋白质折叠
由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象,从而表现出生物学活性或功能。
新生多肽→一级结构→二级结构→三级结构已经具有活性→(对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性。
(七)蛋白质合成抑制剂
•青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用,从而阻遏原核生物蛋白质的合成,抑制细菌生长。
被广泛用于人类医学。
•氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合,又能与真核生物核糖体结合,妨碍细胞内蛋白质合成,影响细胞生长。
氯霉素有时也用于治病,但剂量和周期受到较严控制。
五、蛋白质的运转机制
1、翻译-运转同步机制
2、翻译后运转机制
(1)线粒体蛋白质跨膜运转
(2)叶绿体蛋白质的跨膜运转
3、核定位蛋白的运转机制
4、蛋白质的降解
¶*蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开,蛋白质需要运转。
¶*核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所,任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分,补充和更新细胞功能。
¶*细胞各部分都有特定的蛋白质组分,蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。
¶*细胞中蛋白质的合成:
绝大多数在细胞质中合成;一小部分在细胞器(叶绿体和线粒体)中合成。
¶*定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成,细胞器内合成的留在细胞器内。
¶*蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转(proteintranslocation)。
蛋白质运转的两种方式
翻译-运转同步(co-translationaltranslocation)
◆是即将进入内质网的蛋白质的易位方式;
◆蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合;
◆蛋白质合成时,核糖体定位于内质网表面,称膜结合核糖体(membrane-boundribosome)。
◆分泌蛋白质大多是以同步机制运输的
翻译后运转(post-translationaltranslocation)
◆蛋白质翻译完成后从核糖体上释放,然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。
◆蛋白质合成时,其核糖体不与任何细胞器相连,称游离核糖体(freeribosome)
◆在细胞器发育过程中,由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。
◆参与生物膜形成的蛋白质,依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。
蛋白性质
运转机制
主要类型
分泌
蛋白质在结合核糖体上合成,并以翻译-运转同步机制运输
免疫球蛋白、卵蛋白、
水解酶、激素等
细胞器发育
蛋白质在游离核糖体上合成,以翻译后运转机制运输
核、叶绿体、线粒体、
乙醛酸循环体、过氧化物酶
体等细胞器中
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