环氧合酶2和ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达.docx
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环氧合酶2和ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达
环氧合酶-2和ki-67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
【摘要】目的研究环氧合酶-2(COX-2)和ki-67在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)、宫颈鳞状细胞癌(SCC)中的表达及其相关性。
方法RT-PCR法检测COX-2mRNA在正常、炎性、CIN组织和SCC组织中的表达;免疫组化法检测各组中COX-2和ki-67蛋白的表达。
结果COX-2mRNA和蛋白在正常组无表达,在炎性、CIN和SCC组表达升高(P0.05),COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度有关(P0.05)。
ki-67在正常组中偶有表达,在炎性组和CIN组表达增高,在SCC组显著增高(P0.01)。
COX-2与ki-67蛋白的表达相关(r=0.675,P0.001)。
结论COX-2表达增高可能是宫颈癌发生发展的早期事件,与细胞异常增生有关。
【关键词】环氧合酶-2;Ki-67;宫颈癌;细胞增殖 ABSTRACT:
ObjectiveTostudytheexpressionofcyclooxygenase(COX-2)andki-67inchroniccervicitis,cervicalintraepithelialneoplasia(CIN),squamouscarcinomaofthecervix(SCC)andtheirrelationship.MethodsTissuesampleswereharvestedrespectivelyfromnormal,inflammational,CINand30SCCtissues.TheexpressionofCOX-2mRNAwasdetectedbyRT-PCRmethod.COX-2andki-67proteinsweredetectedbyinmmunohistochemicalmethod.ResultsTheoverallexpressionofCOX-2mRNAandproteinwashigherininflammation,CINandSCCgroupsthanthatinnormalcervix(P0.05).COX-2proteinexpressionwascorrelatedwithtumorsizeandinvasiondepth(P0.05).Ki-67proteinwashigherintheothergroupsthanthatinnormalcervix(P0.05).Ki-67wasexpressedinSCCgroupatahighlevel,whichsignificantlydifferedfromtheexpressionininflammationgroup(P0.01).AsignificantcorrelationwasfoundbetweenCOX-2andki-67protein(r=0.675,P0.001).ConclusionCOX-2maybeanearlyincidentofsquamouscervicalcarcinogenesisrelatedtocellproliferation. KEYWORDS:
cyclooxygenase-2;ki-67;cervicalcarcinoma;cellproliferation环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是炎症反应中催化前列腺素合成的一个限速酶。
有研究发现COX-2在结肠癌、食管癌、宫颈癌中表达升高,其表达同免疫抑制、血管生成、抗凋亡和细胞增殖有关,影响肿瘤的发生发展[1-3]。
ki-67抗原为细胞分裂增殖相关蛋白,可识别生长中的细胞,评估细胞增生[4]。
本研究通过检测COX-2和ki-67在宫颈正常组织、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)、宫颈鳞状细胞癌(squamouscarcinomaofthecervix,SCC)中的表达,探讨COX-2在宫颈癌发生发展中的作用和机制。
1材料与方法 1.1标本来源与分组 实验分2组,实验组均取自西安交通大学医学院第二附属医院2005年11月至2006年3月手术切除并经病理学证实的标本。
其中宫颈癌组30例,患者年龄32-72岁,平均(44.23±8.85)岁;对照组包括,慢性宫颈炎10例,患者年龄29-43岁,平均(30.58±10.25)岁;CIN10例,患者年龄37-50岁,平均(46.50±3.94)岁;正常宫颈10例,患者年龄29-43岁,平均(37.52±6.84)岁。
所有病例术前2周内均未服用消炎痛、阿斯匹林等影响前列腺素代谢的药物。
采得的新鲜组织2份,1份液氮处理后,-80℃冰箱冻存以备RT-PCR检测,另1份4%(体积分数)甲醛溶液固定,石蜡包埋,以备免疫组化染色。
1.2RT-PCR法及结果判定 β-actin(303bp)用于内对照,PBS液代替引物作为阴性对照。
总RNA提取后,紫外分光光度计(美国NanoDropND-100Spectrophotometer仪)检测RNA纯度(1.6),计算出RNA浓度,取2μg进行RT-PCR。
引物设置:
COX-2(530bp)上游引物:
AAGCCTTCTCTAACCTCTCC;下游引物:
TAAGCACATCGCATACTCTG;β-Actin(303bp)上游引物:
AGCGGGAAATTGTGCATG;下游引物:
CAGGGTACCTGGTGGTGCC(由陕西理生医疗科技有限公司合成)。
在同一反应体系,按照RT-PCR酶混合物试剂(陕西理生医疗科技有限公司)说明结合参考文献[5]提供的逆转录系统及参数进行RT-PCR:
37℃反应30min,95℃3min灭活逆转录酶后95℃变性30s,57.4℃退火30s,72℃延伸30s,反应30个循环。
取扩增产物进行0.5mg/L琼脂糖电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果。
用凝胶成像系统进行半定量分析(美国Bio-Rad凝胶成像分析仪,型号:
GelDocEQ),取目的基因条带和β-actin条带强度的比值作为目的基因的相对值。
1.3免疫组化染色及结果判定 常规切片(4μm),脱蜡,柠檬酸沸水修复抗原,其余步骤按SP免疫试剂盒(北京中山试剂公司产品)说明操作。
抗COX-2多克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体购自北京中山试剂公司,工作浓度分别为1∶1200,1∶200。
用已知膀胱癌阳性片作阳性对照,PBS液代替一抗作阴性对照。
结果判断:
COX-2阳性染色主要为胞质,少数为核膜着色。
ki-67阳性染色主要为胞核和核膜着色。
免疫组织化学标本经Image-proplus图像分析软件进行图像分析[6],每个标本随机选取3个高倍视野,测定单位面积下平均灰度值,最后求每张切片的平均灰度值及标准差。
本次测量灰度值标准,极白为255,极黑为0,共256阶。
故染色越浅,灰度值越大;染色越深,灰度值越小,考虑背景色的误差,将灰度值≥200者视为阴性。
1.4统计学处理 所有数据用SPSS11.5统计软件处理。
多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两组间均数比较根据方差是否齐性采用t或t′检验,等级资料采用Spearman相关系数分析,两组计量资料之间的关系采用Pearson相关系数分析,P0.05为有统计学意义。
2结果 2.1COX-2mRNA和蛋白的表达 COX-2蛋白在正常组无表达,炎性、CIN组、SCC组表达依次升高,与正常组比较具有统计学差异(P0.05),但病变各组间无统计学差异(P0.05,表1)。
宫颈病变各组COX-2蛋白表达阳性率增高。
COX-2mRNA在正常组不表达,宫颈病变各组表达升高(图1),但与蛋白表达不完全一致(r=0.135,P=0.68)。
表1COX-2在不同的宫颈组织中的表达(略) 2.2ki-67蛋白在宫颈组织中的表达 ki-67在正常宫颈组偶有表达,炎性、CIN和SCC组中表达依次升高,与正常组比较具有统计学差异(P0.05),炎性组同SCC组比较具有统计学差异(P0.01,表2)。
宫颈病变各组ki-67蛋白表达阳性率增高,COX-2在CIN和SCC组表达阳性率高于ki-67。
2.3COX-2和ki-67蛋白表达范围及其与临床病理特征的关系 炎性和CIN组中,ki-67主要分布在宫颈的副基底层细胞(parabasalsquamouscells)(图2、3),SCC组中ki-67表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞(图4、5)。
COX-2表达范围较ki-67广泛。
CIN组COX-2除表达于副基底层异常的细胞外,病灶周围正常细胞及炎性细胞也有表达,偶见于新生血管内皮细胞,其表达随着与病灶距离的增加而减弱(图2、3);SCC组COX-2除表达于肿瘤细胞外,癌灶周围的炎性细胞及血管内皮细胞也有表达(图4、5)。
COX-2蛋白表达与肿瘤的体积和浸润深度有关(P=0.04,P=0.02),ki-67表达与任何病理特征均无关(表3)。
宫颈病变各组ki-67和COX-2的蛋白表达存在显著直线相关(r=0.675,P0.001,图6)。
表2ki-67蛋白在宫颈组织中的表达(略)表3COX-2和ki-67蛋白在SCC组中的表达(略) 3讨论持续性人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是CIN或宫颈癌发生的一个重要驱动力[4]。
HPV清除与细胞介导免疫高度相关[7]。
Huan等[8]比较宫颈癌癌灶和癌周组织的细胞因子,发现白介素-10(interleukin-10,IL-10)在肿瘤组织中的表达增强,后者与体液介导免疫有关。
在慢性炎症过程中,机体的免疫反应由细胞介导免疫转化为体液介导免疫,COX-2在这一过程中起着重要作用。
研究发现COX-2与人类肿瘤关系密切,其作用机制可能与免疫抑制和细胞增殖有关。
ki-67是一个细胞增殖的重要分子标记物。
宫颈上皮中,ki-67阳性细胞核的分布范围,可以将CIN病变等级准确分类[4]。
John[9]研究在CIN病灶周围的正常细胞,轻度、中度、重度病变细胞中COX-2的表达阳性率,分别为10%、28%、37%、67%,病灶切缘COX-2的表达还可作为一个监测CIN预后的独立指标(相对危险度=0.68)。
John考虑到COX-2染色超过病灶组织平均约1.6mm,故宫颈环状电切术(loopelectrosurgicalexcisionprocedure,LEEP)切除的组织应超过CIN病灶2mm以防止复发。
这一研究提示COX-2表达阳性的细胞,即使组织学形态仍然正常,其生物学行为已经发生改变,易于发展为CIN。
本实验中,CIN组,COX-2在病变细胞及其周围正常细胞均有表达,其表达范围随着与病灶距离的增加而减弱;SCC组COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度相关(P=0.04,P=0.02)。
提示COX-2可能参与宫颈癌病变的发生发展。
Kim等[3]发现宫颈癌中COX-2表达增高的组,其ki-67表达阳性率也增高,故认为COX-2表达与ki-67相关。
Ferrandina等[10]应用COX-2抑制剂治疗宫颈癌,发现其可以抑制癌细胞增殖,使ki-67表达降低。
本实验中,COX-2与ki-67表达存在显著正相关(r=0.675,P0.001)。
ki-67与COX-2蛋白表达范围不同,在CIN和SCC组中,ki-67仅在病灶中表达,COX-2在病灶及其周围组织均表达,其表达阳性率高于ki-67。
结果提示:
COX-2表达增高是较ki-67更早的细胞生物学行为。
不同于ki-67仅表达于病变组织,COX-2在CIN病灶周围正常组织中表达增高,使细胞生物学行为改变,调节宫颈组织局部免疫,促进细胞增殖,产生一个更利于细胞恶变的微环境,影响肿瘤的发生发展和预后。
COX-2促进细胞增殖的确切机制尚不十分清楚,可能与其主要产物PGE2有关。
Dai等[5]发现COX-2mRNA和蛋白在宫颈病变各组的表达升高,mRNA表达阳性率高于蛋白,认为COX-2可能存在转录后调节。
Debnath等[11]研究宫颈癌细胞株紫外线照射下不同时段COX-2的表达,认为射线刺激COX-2mRNA表达量增高,而mRNA稳定因子CUGBP2表达也升高,COX-2蛋白表达被抑制,其量没有明显改变。
本实验中,COX-2mRNA和蛋白在宫颈病变各组表达均升高,但两者表达不完全一致(r=0.135,P=0.68)。
这种差异是否与这一稳定因子有关尚待进一步研究。
COX-2蛋白表达增高可能是细胞生物学行为改变的早期事件。
COX-2通过调节宫颈局部免疫,影响细胞增殖,促进一个更利于细胞恶变的环境产生,促使宫颈由慢性宫颈炎向CIN和SCC转变。
COX-2在宫颈癌早期发生阶段起着重要作用,这为预防宫颈癌提供了新的思路。
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