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冻干蟾皮凝胶剂质量标准及初步药效学研究
冻干蟾皮凝胶剂质量标准及初步药效学研究
[摘要]目的建立冻干蟾皮凝胶剂质量标准和初步药效学研究。
方法采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基进行定性鉴别,高效液相色谱(HPLC)法测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱柱kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
乙腈(A)-水(B)(48?
U52);流速:
1mL/min;检测波长:
296nm;柱温:
30℃;进样量:
10μL。
采用S180腹水型实体瘤小鼠进行初步抑瘤药效学研究。
结果硅胶G薄层板上,在与对照品色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度良好。
华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.056~4.48μg/mL,0.256~10.24μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系(r=0.9987、0.9996)。
加样回收率(n=6)为100.27%、101.68%,相对标准偏差为1.56%、1.67%。
初步药效学结果显示冻干蟾皮凝胶剂不同剂量组均有显著抗肿瘤作用,且高剂量组效果最佳,抑瘤率为48.03%。
结论建立了冻干蟾皮凝胶剂质量标准,初步药效学表明冻干蟾皮凝胶剂具有显著抗肿瘤作用。
[关键词]冻干蟾皮凝胶剂;质量?
俗迹豢怪琢觯换?
蟾酥毒基;酯蟾毒配基
[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2018)04(a)-0029-05
[Abstract]ObjectiveToestablishthequalitystandardandpreliminarypharmacodynamicstudyofFreeze-driedToadSkinGel.MethodsTLCwasusedforthequalitativeidentificationofCinobufaginandResibufogenin,HPLCwasadoptedtodeterminecontentofCinobufaginandResibufogenin.Chromatographiccolumn:
kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm);flowingphase:
acetonitrile(A)-water(B)(48∶52);flowrate:
1mL/min;UVdetectionwavelength:
296nm;columntemperature:
30℃;thevolume:
10μL.S180ascitessolidtumormicewereusedtostudythepharmacodynamicsofinhibitionoftumorgrowth.ResultsThefluorescencespotsofthesamecolorwereshowninthecorrespondingpositionoftheSilicagelGthinlayer,andthespotsizewasmoderateandtheseparationdegreewasgood.CinobufaginandResibufogeninshowedgoodlinearitybetweenthepeakareaandtheconcentrationintherangeof0.056-4.48μg/mL(r=0.9987)and0.256-10.24μg/mL(0.9996),respectively.Thesamplerecoveryrate(n=6)was100.27%,101.68%,RSDwas1.56%and1.67%.ThePreliminarypharmacodynamicsstudyshowedthatallgroupsofFreeze-driedToadSkinGelhadsignificantanti-tumoreffect,andthehigh-dosegrouphadthebesteffect,withtheinhibitoryrateof48.03%.ConclusionThequalitystandardofFreeze-driedToadSkinGelisestablished,andthepreliminarypharmacodynamicsshowsthatithasasignificantanti-tumoreffect.
[Keywords]Freeze-driedToadSkinGel;Qualitystandard;Anti-tumor;Cinobufagin;Resibufogenin
蟾皮(Coriumbofonis),又称蛤?
M皮(《医方约说》),癞蟆皮(《中药材手册》),蟾蜍皮、蛤蟆皮(《中草药学》),为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的干燥皮,自古至今沿用,其性味辛、凉、微毒,主入胃经,具有清热解毒,利水消胀的功效,近年来,用于多种癌症的治疗和配合放、化疗,不仅能够有效抑制癌细胞的过度增殖,还具有改善血象,减轻放、化疗毒副作用的功效[1-3]。
冻干蟾皮凝胶剂为鲜蟾皮低温冷冻干燥后采用超微粉碎技术[4],并辅以高分子材料为基质制成的外用凝胶剂[5-7],该剂型剂量可控,透皮吸收迅速[8-9],药物吸收干扰因素小,避免药物的肝脏首过作用[10-11],血药浓度稳定,能够有效提高药物生物利用度,并可反复敷贴,随时停药,使用方便,对皮肤无刺激性和致敏性[12-14]。
2.2.8重复性试验精密平行称取同一批冻干蟾皮凝胶剂6份,按照“2.2.3”项下供试品制备方法制备,所得样品按以上色谱条件连续平行进样6次,分别测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量。
结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基?
舛?
RSD均小于3%(表2),表明该方法重现性良好。
2.2.9稳定性试验精密称取冻干产品凝胶剂0.4g,按照“2.2.3”供试品处理方法制备供试品溶液。
分别于0、2、4、8、16、24h时注入液相色谱仪,测定供试品溶液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,考察其稳定性。
结果显示:
华蟾酥毒基和酯蟾毒配基浓度RSD均小于2%(表3),表明供试品溶液在24h内稳定。
2.2.10回收率试验精密称取对照品华蟾酥毒基和酯蟾毒配基适量,加入到已知浓度两者含量的供试品中,在以上色谱条件下,测定两者含量,计算加样回收率。
结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基平均回收率分别为100.27%、101.68%,RSD均小于2%(表4、5),表明该方法准确性良好。
2.2.11含量测定方法分别取批号20170322、20170327和20170411共3批冻干蟾皮凝胶剂,按照“2.2.3”项下的供试品制备方法处理,平行制备6份供试品溶液。
按照“2.2.1”项下的色谱条件进样10μL,测定峰面积。
测得样品中华蟾酥毒基分别为208.77、199.74、207.32μg/g;酯蟾毒配基分别为192.22、181.87、186.63μg/g。
结果表明,即每l克凝胶所含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量分别不得低于190μg和180μg,两者总量不低于370μg。
2.3初步药效学研究
2.3.1S180荷瘤小鼠模型建立自液氮罐中取出S180腹水型肿瘤细胞株1支,置于37℃电热恒温水浴锅内,轻轻摇动使其缓慢融化,取出冻存管,用酒精消毒后备用,吸出细胞悬液,注入离心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培养基,制成肿瘤细胞混悬液,台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。
消毒小鼠背臀部,取0.2mL(1×106~2×106个瘤细胞)接种于皮下,传代3次[11-12]。
选择接种8d的S180荷瘤小鼠,脱颈处死,抽取小鼠腹腔内腹水,用生理盐水适当稀释后,计数,调整浓度至2×107,用无菌注射器吸取瘤细胞混悬液注射在小鼠背臀部,每只0.2mL,4~6d后背臀部测量肿瘤体积均达50~80mm3。
2.3.2实验分组和给药接种瘤细胞后的ICR小鼠60只,称重记录体重,按体重和性别随机分为6组,分别为冻干蟾皮凝胶剂高剂量组4g/kg(蟾皮高剂量组)、冻干蟾皮凝胶剂中剂量组2g/kg(蟾皮中剂量组)、冻干蟾皮凝胶剂低剂量组1g/kg(蟾皮低剂量组)、蟾酥凝胶剂中剂量组0.054g/kg(蟾酥中剂量组)、空白凝胶剂组(阴性组)、环磷酰胺组0.5mg/20g(阳性组),每组10只,每只均单笼饲养。
饲养环境:
室温为(22±2)℃,湿度为(50±10)%。
所有小鼠均于12h光照和12h黑暗环境下适应性饲养数天,自由饮食饮水。
给药之前禁食12h,全程不禁水。
2.3.3数据收集除阳性组腹腔注射外,其余组别均采用背臀部涂抹给药连续20d,观察记录小鼠的一般情况(外观、毛色、饮食、行为、分泌物、排泄物、中毒表现和死亡情况等),每日称荷瘤小鼠重量,停药后第2天记录体重,处死后解剖,剥取肿瘤组织、脾脏、胸腺,电子天平精密称重。
2.3.4检测指标抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%;脾指数=脾重量(mg)/体重(g);胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)。
2.4统计学方法
采用SPSS16.0版统计软件进行数据处理,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,多组数据间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。
计数资料以率表示,采用χ2检验。
以P<0.05为差异有统计学意义
2.5实验结果
在观察期间小鼠的一般情况总体良好,由于肿瘤接种于小鼠背臀部,该部位血管分布较少,导致肿瘤生长相对缓慢,对小鼠活动能力无显著影响,实验过程中无小鼠死亡。
在接种后5~7d,肉眼可见实体瘤生成,各组小鼠给药后的抑瘤率情况比较,所有给药组均与阴性组比较,差异有统计学意义(P0.05)。
见表6。
3讨论
本品性状为深灰色半固体,pH值介于5~7之间,与人体皮肤值相近,有利于延长药物在皮肤表面的滞留时间。
在定性定量测定中,均采以甲醇为溶剂将凝胶剂溶解分散后加热回流,过膜、测定,使主药尽可能溶出,同时可去除辅料的干扰。
薄层色谱鉴别参照《中国药典》2015年版(四部)通则0502薄层色谱法试验华蟾酥毒基和酯蟾毒配基采用环己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展开,10%硫酸乙醇溶液显色,紫外365nm处分别显示黄色和蓝紫色荧光,阴性无干扰。
采用HPLC测定制剂中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱条件为色谱柱:
kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)(瑞典);流动相:
乙腈(A)-水(B)(48?
U52);流速:
1mL/min;柱温:
30℃;检测波长:
296nm。
在上述实验条件下,测得冻干蟾皮凝胶剂中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量不低于380μg/g,该测定方法简便易行,精密度、重现性良好。
蟾酥中以华蟾酥毒基和酯蟾毒配基为代表的脂溶性成分,具有较强的抗肿瘤活性,本课题采用蟾皮和蟾酥分别制成凝胶剂给药后,发现在相同含量的有效成分下,两者对肿瘤的抑制率不存在显著性差异。
腹腔注射阳性药环磷酰胺抑瘤率较差,可能原因为本课题采用背部皮下接种,腹腔注射为全身作用,对于局部治疗效果较差。
脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官,二者对细胞毒药物敏感性较高,在化疗药物作用下明显萎缩,其组织结构发生器质性损伤,是评价药物疗效的重要免疫指标。
本实验由于条件限制未对凝胶剂微生物限定和皮肤刺激性进行研究,课题组将继续完善制剂的相关研究,同时仅完成初步药效学研究,后续将进行细胞水平和整体水平完整的药效学研究,为后续的新药研发奠定基础。
[参考文献]
[1]张振海,王晋艳,陈彦,等.不同品种及产地蟾皮中抗肿瘤活性成分含量比较[J].中华中医药杂志,2011,26(11):
2698-2701.
[2]樊佳佳,宋明,宋驰,等.中药材蟾皮及其混伪品的DNA条形码鉴定研究[J].中国药学杂志,2015,55(15):
1292-1296.
[3]张振海,王晋艳,陈彦,等.不同品种及产地蟾皮中抗肿瘤活性成分含量比较[J].中华中医药杂志,2011,26(11):
2698-2701.
[4]王燕华,金春爱,孙印石,等.不同加工方式的鹿茸脂肪酸的气相色谱分析[J].中草药,2017,48(12):
2431-2440.
[5]辛少鲲,司南,王宏洁,等.蟾皮中亲水性成分的化学研究[J].中国中药杂志,2016,41(20):
3767-3772.
[6]赖宝林,王利胜,张升,等.中药凝胶剂的研究进展[J].中药新药与临床药理,2010,21
(2):
211-213.
[7]谷福根,张艺馨,王毅,等.甲磺酸雷沙吉兰鼻用凝胶剂的制备及质量评价[J].中国新药杂志,2017,26(3):
351-355.
[8]邱仁杰,黄艺钟,王秀丽.乳剂型凝胶剂预混辅料的初步研制[J].中国中药杂志,2017,42(3):
498-504.
[9]曾明辉,熊静悦,朱九群,等.析因设计优化塞来昔布凝胶中透皮促渗剂用量研究[J].中国药学杂志,2017,52(4):
293-296.
[10]MunarinF,TanziMC,PetriniP.Advancesinbiomedicalapplicationsofpectingels[J].IntJBiolMacromol,2012,51(4):
681-689.
[11]PeetersJ,NeeskensP,TollenaereJP,etal.Charaeterizationoftheinterationof2-hydroxypropyl-β-cyclodextrinwithitraconazoleatpH2,4and7[J].JPharmSci,2002,91(6):
1414-1422.
[12]WangDL,QiFH,TangW,etal.ChemicalconstituentsandbioactivitiesoftheskinofBufobufogargarizansCantor[J].ChemBiodivers,2011,8(4):
559-567.
[13]郝敏,?
兔林,毛春琴,等.基于中药质量标志物的饮片质量控制研究[J].中草药,2017,48(9):
1699-1707.
[14]张永文.试谈中药新药质量标准制定的整体思路[J].中国新药杂志,2017,26(18):
2185-2189.
[15]黄玉叶,宋霄宏.蟾皮的提取和含量测定及临床应用研究进展[J].中华中医药学刊,2011,29(7):
1636-1638.
[16]昝日增,胡万杨,黄玉叶,等.干蟾皮中蟾毒内酯类成分的提取工艺研究[J].中草药,2011,42(7):
1330-1332.
[17]谢红梅,赵丹丹,李雅雅,等.蟾皮凝胶剂制备工艺优选及体外透皮性能考察[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(12):
21-24.
[18]张璐璐,张维东,武力存,等.蝎毒多肽提取物促进自噬抑制S180肉瘤作用机制的研究[J].中草药,2015,46(8):
1190-1194.
[19]LiuR,LiJ,ZhangT,etal.Itraconazolesuppressesthegrowthofglioblastomathroughinductionofautophagy:
Involvementofabnormalcholesteroltrafficking[J].Autophagy,2014,10(7):
1241-1255.
[20]郑婷婷,付艳丽,焦丽静,等.解毒散结方醇提物抗裸小鼠人肺癌术后转移作用的研究[J].中药新药与临床药理,2016,27(6):
815-821.
[21]张璐璐,张维东,武力存,等.蝎毒多肽提取物促进自噬抑制S180肉瘤作用机制的研究[J].中草药,2015,46(8):
1190-1194.
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