黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备.docx
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黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备.docx
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黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备
园艺学报2014,41(6):
1207–1217http:
//www.ahs.ac.cn
ActaHorticulturaeSinicaE-mail:
yuanyixuebao@
收稿日期:
2013–11–26;修回日期:
2014–04–28
基金项目:
国家自然科学基金项目(31101584);国家重点基础研究发展计划(‘973’)项目(2009CB19001);国家现代农业产业技术
体系建设专项资金项目(CARS-25);农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
*共同第一作者
**通信作者Authorforcorrespondence(E-mail:
jiangwj@)
黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体
制备
王燕*,杨学勇*,刘晓林,张晓孟,余宏军,蒋卫杰**
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)
摘要:
以黄瓜果实总RNA为模板,通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序
列,进行测序,构建T-easy载体。
SMART在线预测CsKF1和CsKF2均含有动蛋白(Kinesin)约340个
氨基酸残基的马达区保守序列(moterdomain)。
体外表达蛋白的马达区和非马达区,将带有His标签的
CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M融合蛋白通过E.coliBL21(DE3)表达,摸索不同诱导条件
下目的蛋白的表达和纯化。
其中His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M原核表达蛋白的分子量分别
为25、30和40kD,均以0.1mmol·L-1IPTG,22℃6h诱导表达效果最好。
His-CsKF2-M原核表达蛋
白的分子量约38kD,以18℃8h诱导表达效果最好。
融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C经过亲和
纯化后作为抗原,通过5轮免疫注射兔子后,取心脏血作为抗血清,通过AminoLinkPluskit试剂盒亲和
纯化得到多克隆抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C。
经过Westernblot分析表明多克隆抗体具有特异性,
可与抗原特异结合。
关键词:
黄瓜;果实;动蛋白;肽段;原核表达
中图分类号:
S642.2文献标志码:
A文章编号:
0513-353X(2014)06-1207-11
ProkaryoticExpressionandPolyclonalAntibodyPreparationofKinesin
PeptideSegmentfromCucumber
WANGYan*,YANGXue-yong*,LIUXiao-lin,ZHANGXiao-meng,YUHong-jun,andJIANGWei-jie**
(InstituteofVegetableandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)
Abstract:
UsingthetotalRNAofcucumber(CucumissativusL.)fruitsasthetemplate,wecloned
twonovelKinesingenesCsKF1andCsKF2byRT-PCR.Theresultsfromdeducedproteinsequence
analysisindicatedthatbothCsKF1andCsKF2containmoterdomainofkinesinfamily.Forprotein
expressioninvitro,thecodingregionsforKF1-N,KF2-C,KF1-motorandKF2-motorwereamplifiedby
PCRandinsertedintoeitherthepET28avectororthepET30avectorandthentransformedintoE.coli
strainBL21(DE3).SDS-PAGEanalysisresultsshowedthattherecombinantplasmidHis-CsKF1-Nand
His-CsKF1-N,His-CsKF2-C,His-CsKF1-Mcouldbeexpresseda25kD,30kD,40kDmoleculemass
1208园艺学报41卷
offusionproteinwith0.1mmol·L-1isopropylthiogalactosidefor6hat22℃.ButHis-CsKF2-Mcould
beexpresseda38kDmoleculemassoffusionproteinwith0.1mmol·L-1isopropylthiogalactosidefor8h
at18℃.TheHis-taggedfusionproteinswerepurifiedusingaNi2+-chelatingSepharoseFastFlow
(AmershamBiosciences)column.Polyclonalanti-CsKF1-N,anti-CsKF2-Cantibodieswereraisedin
rabbitsusingthepurifiedHis-CsKF1-NandHis-CsKF2-Cproteinastheantigens.Antiserumwasthen
affinitypurifiedusingtheAminoLinkPluskitwithimmobilizedantigensaccordingtothemanufacturer’s
instructions.Westernblotanalysisshowthatthepolyclonalantibodiescouldspecificallyidentifythe
correspondingantigenpeptidesHis-CsKF1-N,His-CsKF2-C.
Keywords:
cucumber;fruit;Kinesin;peptidesegment;prokaryoticexpression
大多数植物的果实发育分为3个时期:
子房发育、细胞分裂、细胞膨大(Gillaspyetal.,1993)。
黄瓜(CucumissativusL.)果实在前2周生长中经过快速细胞分裂和细胞膨大,质量增加了200多
倍(Marcelis&Hofmaneijer,1993;Boonkorkaewetal.,2008;Fuetal.,2008,2010)。
黄瓜采收一
般在果实发育前期(Andoetal.,2012),因此,早期的细胞快速分裂和膨大对于果实产量至关重要。
目前,很多研究都关注于果实成熟期和采后生理,而对果实早期发育机理,尤其果实早期的细胞分
裂和膨大机理尚不清楚。
动蛋白是首先在动物神经细胞中发现的一类依赖于微管的马达蛋白(Valeetal.,1985),在细胞
有丝分裂、减数分裂、维持细胞形态和细胞器的运输方面都发挥着重要作用(Lee&Liu,2004;Lu
etal.,2005;Vanstraelenetal.,2006;Hirokawaetal.,2009;Lietal.,2011;Zhouetal.,2011)。
在植物中,已有报道的动蛋白ATK1、ATK5、AtKRP125c、AtPAKRP1和AtKINESIN-13A都以依
赖于微管的方式参与了细胞分裂和膨大(Lee&Liu,2000;Chenetal.,2002;Ambrose&Cyr,2007;
Banniganetal.,2007)。
黄瓜果实发育早期细胞分裂和细胞膨大有其独到的特点,例如其分裂和膨
大的速度极快,然而,在黄瓜果实发育早期是否有动蛋白的参与?
又是有哪些特异动蛋白参与调控,
目前尚未可知。
目前关于动蛋白在果实发育早期细胞快速彭大和快速分裂中的作用尚未见报道,黄瓜是果实早
期发育研究的典型物种,所以选择黄瓜作为研究对象。
关于黄瓜中动蛋白特异肽段的原核表达和多
克隆抗体制备的研究目前也未见报道。
本试验中找到了两个在黄瓜果实发育早期特异表达的动蛋白,
通过对这两个基因进行克隆,经过多次原核表达、纯化以及诱导条件的摸索和优化,得到了高效表
达且纯度较高的蛋白特异肽段,最终得到特异识别目的蛋白的抗体,为其在黄瓜果实细胞分裂和细
胞膨大过程中的表达、定位和功能研究奠定了重要基础,也为研究黄瓜果实早期发育的分子机理提
供了理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培温室内进行,黄瓜(CucumissativusL.)‘9930’
由中国农业科学院蔬菜花卉研究所顾兴芳和黄三文老师提供。
2011年1月10日播种于穴盘,1月下
旬定植。
取健康植株选第5节位以上果实组织液氮速冻,–80℃保存。
大肠杆菌菌株DE3(BL21)及质粒pET28a(+)和pET30a(+)为本实验室保存。
质粒小量提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自QIAGEN公司。
LATaq聚合酶、T4DNA连
6期王燕等:
黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备1209
接酶、dNTPs、DNAMarker、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司。
pGEMT-easy购自Promega公
司。
反转录试剂盒购自Fermentas公司。
引物合成和测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。
1.2CsKF1和CsKF2特异肽段的原核表达载体构建
以黄瓜果实总RNA为模板,通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序列,
进行测序,构建T-easy载体(Yangetal.,2013)。
对这两个动蛋白二级结构进行预测,决定CsKF1
原核表达的特异肽段为5′端的1~504bp(KF1-N),马达区为504~1497bp(KF1-M);而CsKF2
原核表达的特异肽段为5′端的1~591bp(KF2-C),马达区为315~1356bp(KF2-M),分别设计
特异引物如下。
KF1-N-F:
GAATTCATGAATGGAATGGGGAGA;KF1-N-B:
GTCGACTCAAGAGT
TTGCCCTCTCT;KF1-M-F:
GGATCCATGGTTGCCAAGATCAAAG;KF1-M-B:
CTCGAGTCAGAC
ATTATTTCCTTTTGAAAG;KF2-C-F:
GAATCCATGATAAGAGCAAATGCCAAC;KF2-C-B:
GTCG
ACTCAAAGATCGTCTACGTGGTT;KF2-M-F:
GGTACCATGGATCCACCCATCAAG;KF2-M-B:
CTCGAGTCATTCATTTATGATTGGCTGA。
以连接有CsKF1全长CDS的T-vector为模板,PCR扩增相应CsKF15′端序列和马达区序列,
并在序列两端分别引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。
PCR回收产物、原核表达载体pET28a(+)经
SalⅠ和EcoRⅠ双酶切消化后,通过T4DNALigase将KF1-N和KF1-M连接到pET28a(+)上。
挑取
单菌落进行PCR和双酶切鉴定,并测序确认序列正确。
构建好的载体定名为pET28a-CsKF1-N和
pET28a-CsKF1-M。
以连接有CsKF2全长CDS的T-vector为模板,PCR扩增相应CsKF25′端序列和马达区序列,
并在序列两端分别引入KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。
PCR回收产物、原核表达载体pET30a(+)经
KpnⅠ和XhoⅠ双酶切消化后,通过T4DNALigase将KF2-C和KF2-M连接到pET30a(+)上。
挑取
单菌落进行PCR和双酶切鉴定,并测序确认序列正确。
构建好的载体定名为pET30a-CsKF2-C和
pET30a-CsKF2-M。
1.3序列分析
通过SMART(http:
//smart.embl-heidelberg.de/)在线进行基序(motif)和结构域(domain)预
测。
采用DNAman和Mega5.0软件进行序列比对和进化树构建。
1.4融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE电泳分析
1.4.1重组细胞培养
挑取含有重组质粒pET28a-CsKF1-N,pET28a-CsKF1-M,pET30a-CsKF2-C,pET30a-CsKF2-M
的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种到含有50µg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡
培养过夜。
次日将过夜培养物以1︰100的比例转接到25mL含50µg·mL-1卡那霉素的LB液体培
养基中,37℃振荡培养约2.5h至OD6000.6~0.8时取少量菌液离心后用1×SDS制样(诱导前样),
其余菌液加入IPTG至终浓度0.1mmol·L-1。
1.4.2诱导条件的筛选
以200r·min-1转速继续培养细胞,诱导条件分别设为18℃6h、18℃8h、22℃6h、22℃8h。
重复3次。
最终获得的目的蛋白产物经过SDS-PAGE检测后,确定最佳诱导条件。
1.4.3融合蛋白在原核细胞中的诱导表达与纯化
将上述不同诱导条件下得到的菌液,于4℃,5000r·min-1离心10min,弃上清液,收集菌体
后用M端裂解缓冲液(0.1mol·L-1PIPES,pH6.9;1mmol·L-1MgCl2,2mmol·L-1EGTA,10%
1210园艺学报41卷
甘油)和N/C端裂解缓冲液(25mmol·L-1Tris-HCl,pH7.5;150mmol·L-1NaCl,10%甘油),用
移液器轻轻吸打使菌体充分悬起,相同条件下离心,收集菌体沉淀–80℃冻存或继续进行破碎纯化。
加入裂解缓冲液用移液枪将菌体充分悬起并加入PMSF至1mmol·L-1,冰浴下进行超声波破碎细胞,
每次破碎20s,期间停止1min,10次左右(破碎时间与菌体体积和超声破碎仪功率有关)。
超声破
碎后取15µL菌液加入5µL4×SDS样品缓冲液制样(记作:
诱导后样),以下制样方法相同。
细胞
破碎完成后,4℃,12000×g离心30min,取上清液(含目标蛋白的细菌可溶性总蛋白提取液)制
样(记作:
上清样),沉淀用裂解缓冲液重悬后制样(记作:
沉淀样),其余上清液上镍柱进行纯化。
尽量使样品缓慢通过柱床,将穿柱液重复上样1次,收集穿柱液15µL加入5µL4×SDS制样(记
作:
穿柱样)。
随后用6~8倍体积的裂解缓冲液洗去大多数的杂蛋白,再用6~8倍体积的含有100
mmol·L-1咪唑的清洗缓冲液洗涤柱床1次,取洗涤后流出液体15µL加入5µL4×SDS制样(记作:
洗涤样)。
最后用含有300mmol·L-1咪唑的洗脱缓冲液洗脱3次,收集第1、2、3次洗脱液体制样
(分别记作:
洗脱样1、2、3)。
1.4.4SDS-PAGE电泳
取20µL已经加入了SDS缓冲液的蛋白样品,沸水中加热3~5min,12000×g离心2min,取
上清液点样。
12.5%SDS-PAGE电泳检测,比较结果确定适宜诱导条件。
1.5His-CsKF1-N和His-CsKF2-C大量诱导表达与纯化
适宜诱导条件确定后,用500mLLB(含50µg·mL-1卡那霉素)进行菌液大量诱导His-CsKF1-N,
菌体离心后用裂解缓冲液充分悬浮并加入PMSF至1mmol·L-1,TAE至1mmol·L-1,溶菌酶至2
mmol·L-1,然后置于冰上超声破碎细胞。
细胞破碎完成后4℃,12000×g离心30min,取上清液
上镍柱进行纯化。
镍柱用5~10倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后上样,随后用6~8倍体积的裂解
缓冲液洗去大多数的杂蛋白,再用6~8倍体积的含有100mmol·L-1咪唑的清洗缓冲液洗涤1次,
最后用5~10mL含有300mmol·L-1咪唑的裂解缓冲液,按每个离心管收集500µL进行分部收集,
标记为样品1、样品2、……样品7,各取15µL,加入5µL4×SDS制样检测。
His-CsKF2-C是以包
涵体形式存在,与His-CsKF1-N纯化方法不同,在细胞破碎离心后,在沉淀中加入裂解缓冲液并加
入triton(2%)、PMSF进行充分重悬,离心后留上清液。
获得的目的蛋白产物经过SDS-PAGE检测,
用Bio-Rad蛋白浓度测定试剂(Bio-Radproteindyereagent)进行测定后用于活性分析。
1.6多克隆抗体制备及纯化
将纯化的抗原蛋白送中国科学院遗传研究所实验动物中心制备多克隆抗体,对兔子共免疫5次
后取血清测效价,最后取心脏血得到抗血清。
多克隆抗体的纯化使用PIERCE公司的AminoLinkPlus
ImmobilizationKit进行,具体纯化步骤参见说明书。
1.7Westernblot分析
进行SDS-PAGE,使用半干式转移电泳槽装置将纯化后的原核表达产物His-CsKF1-N和
His-CsKF2-C从SDS-PAGE凝胶电转移到硝酸纤维素膜(NC)上。
转移后的NC膜用丽春红染色,
做好标记后,在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液(50mmol·L-1Tris-HCl,pH7.5,150mmol·L-1NaCl,
0.05%Tween20中室温封闭1h后,TBST洗涤10min,加入用封闭液制备的纯化抗体anti-CsKF1-N
和anti-CsKF2-C(稀释度1︰2000),4℃孵育过夜,用TBST洗膜3次,每次10min。
用碱磷酶标
记的羊抗兔抗体为二抗(稀释度1︰5000)室温孵育1h,用TBST洗膜3×10min后,加入10mLAP
反应缓冲液,先加入15µLNBT充分混匀,再加入10µLBCIP,混匀约5min左右可见条带。
根据
6期王燕等:
黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备1211
条带的位置是否符合预期CsKF1-N和CsKF2-C的大小从而判断抗体的特异性。
2结果与分析
2.1黄瓜果实动蛋白基因CsKF1和CsKF2cDNA全长的获得
以黄瓜果实总RNA反转录cDNA为模板进行PCR扩增。
扩增得到CsKF1和CsKF2的基因编
码序列(CDS)分别为2058bp和3420bp。
扩增产物经纯化后克隆到pGEMT-easy载体上(Yanget
al.,2013)。
测序结果经过DNAman进行分析比对,表明所克隆的CsKF1和CsKF2基因编码序列
与黄瓜基因组数据库中所登录的Csa7G446860(2058bp)和Csa3G062600(3420bp)编码序列完
全相同。
2.2序列分析
CsKF1的CDS序列为2058bp,推导出氨基酸残基为686aa,对该蛋白结构域进行分析(图1),
动蛋白CsKF1的保守马达区(kinesinmotordomain)位于总蛋白168~499aa区域(灰色区域),ATP
结合位点位于马达区内(178~179aa,261~268aa)。
CsKF2的CDS序列为3420bp,推导出氨基
酸残基为1140aa,CsKF2动蛋白保守马达区位于总蛋白106~442aa区域(灰色区域),ATP结合
位点位于马达区内(115~116aa,183~190aa)。
图1CsKF1和CsKF2的氨基酸序列
Fig.1ThededucedaminoacidsequenceofCsKF1andCsKF2
将拟南芥33个动蛋白氨基酸序列与CsKF1和CsKF2进行同源性分析,从进化树(图2)可以
看出,CsKF1与拟南芥动蛋白13家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到73%,CsKF2与拟南芥动蛋
白12家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到92%。
2.3黄瓜果实动蛋白基因原核表达载体的构建
应用PCR方法扩增获得KF1-N(504bp),KF1-M(1002bp)基因片段(图3,A、B),经过
内切酶、连接酶将其插入pET-28a(+)载体中,将pET28a-CsKF1-N,pET28a-CsKF1-M,经EcoRⅠ/SacⅠ
双酶切鉴定(图3,C)。
同样将扩增获得的KF2-C(594bp),KF2-M(1044bp)基因片段(图3,
A、B)经过内切酶、连接酶将其插入pET-30a(+)载体中,获得的pET30a-CsKF2-C,pET30a-CsKF2-M
进行KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定(图3,C)。
测序证实重组质粒的外源基因插入正确。
2.4黄瓜动蛋白马达区在原核细胞中的诱导表达与纯化
将重组质粒pET28a-CsKF1-M质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内。
分别在186℃
h、188h℃、226h℃、228h℃几种不同的条件下诱导,与诱导前对照相比,与预测分子量相当
的约40kD的His-CsKF1-M蛋白被大量诱导表达(图4,A),4个条件相比较而言,226h℃诱导
的蛋白浓度明显比其他3个条件下的高,杂带也最少,因此将该条件设为大量诱导的适宜条件。
1212园艺学报41卷
图2CsKF1和CsKF2与拟南芥动蛋白家族氨基酸序列同源性进化分析
Fig.2Phylogenetictreeanalysisofthededucedaminoacidsequenceshomolog
ofCsKF1andCsKF2withArabidopsisKinesinfamily
图3特异肽段的PCR(A、B)和双酶切检测(C)
Fig.3PCR(A,B)andrestrictionenzymedigestionanalysis(C)ofpET28a-CsKF1-N/MandpET30a-CsKF2-C/M
M:
DL2000DNAmarker;1:
pET28a-CsKF1-N;2:
pET30a-CsKF2-C;
3:
pET28a-CsKF1-M;4:
pET30a-CsKF2-M.
同
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- 黄瓜 蛋白 特异 表达 克隆 抗体 制备