蛹虫草黄豆粉发酵饮料的免疫活性研究.docx
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蛹虫草黄豆粉发酵饮料的免疫活性研究
青岛农业大学
毕业论文(设计)
题目:
蛹虫草黄豆粉发酵饮料的免疫活性研究
姓名:
43
学院:
食品科学与工程学院
专业:
生物工程
班级:
201002
学号:
20105666
指导教师:
朴美子
2014年6月6日
毕业论文(设计)诚信声明
本人声明:
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与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
论文(设计)作者签名:
日期:
年月日
毕业论文(设计)版权使用授权书
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本人离校后发表或使用该毕业论文(设计)或与该论文(设计)直接相关的学术论文或成果时,单位署名为青岛农业大学。
论文(设计)作者签名:
日期:
年月日
指导教师签名:
日期:
年月
目录
中文摘要I
AbstractII
1前言1
1.1蛹虫草的概述1
1.2蛹虫草液体发酵的研究现状1
1.3功能性饮料的研究现状2
1.4研究目的及意义4
2材料与方法4
2.1材料与试剂4
2.1.1蛹虫草豆粉发酵液的制备工艺流程4
2.1.2菌株的活化4
2.1.3种子液的制备4
2.1.4蛹虫草黄豆粉发酵饮料制备工艺流程5
2.2设备与仪器6
2.3实验方法6
2.3.1小鼠的饲喂6
2.3.2血浆的制备6
2.3.3肝脏匀浆的制备7
2.3.4蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫器官指数的影响7
2.3.5蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆中免疫功能指标的影响7
2.3.6蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠肝脏组织匀浆中免疫功能指标的影响8
3数据处理与分析8
3.1蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫器官指数的影响8
3.2蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆和肝脏中IgG含量的影响8
3.3蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆和肝脏中IgM含量的影响9
3.4蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆和肝脏中IFN-γ含量的影响10
3.5蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆和肝脏中IL-4含量的影响10
4结论与展望11
4.1结论11
4.2展望11
参考文献13
致谢14
蛹虫草黄豆粉发酵饮料的免疫活性研究
生物工程专业王启昌
指导老师朴美子
摘要:
本论文以蛹虫草为研究对象,通过液体发酵黄豆粉制备蛹虫草黄豆粉发酵饮料,研究其在小鼠体内的免疫活性。
结果表明:
与空白组相比,高剂量组蛹虫草黄豆粉发酵饮料能显著提高小鼠血浆中IgM、IL-4和IFN-γ的含量,分别提高21.52%、26.76%、15.00%,且能显著提高小鼠肝脏中IgG、IgM、IL-4和IFN-γ的含量,分别提高29.50%、36.12%、21.20%、21.92%(P<0.05)。
另外,与香菇多糖阳性组相比,高剂量组蛹虫草黄豆粉发酵饮料能显著提高血浆中IL-4和IFN-γ的含量,以及肝脏中IgG、IgM和IL-4的含量(P<0.05)。
关键词:
蛹虫草;发酵饮料;免疫活性
ImmuneactivityoffermentedsoybeanbeveragewithCordycepsmilitaris
StudentmajoringinbioengineeringWangQichang
TutorPiaoMeizi
Abstract:
ThefermentationprocessforanewbeveragewasdevelopedbyCordycepsmilitariswithsoybeanmealasthemainmaterialandtheimmuneactivityofthisbeverageinvivowasfurtherstudied.TheresultsshowedthattheconcentrationsofIgG,IgM,IL-4andIFN-γinplasmaweresignificantlyincreasedby21.52%,26.76%and21.52%respectively,ascomparedwiththecontrol.TheconcentrationsofIgG,IgM,IL-4andIFN-γinthelivercellwerealsoenhancedby29.50%,36.12%,21.20%and36.12%respectivelywhencomparedwiththecontrol.Moreover,highconcentrationofthisfermentationbeveragecouldincreasetheconcentrationsofIl-4andIFN–γinthecellaswellastheconcentrationsofIgG、IgMandIL-4inthelivercells.
Keywords:
Cordycepsmilitaris;fementedsoybeanbeverage;Immuneactivity
1前言
1.1蛹虫草的概述
蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.)Link),也通常被称为北冬虫夏草或者北虫草,分类学上属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属真菌的模式种[1],主要寄生于鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等昆虫,以及鞘翅目金龟科的幼虫或蛹体上[2]。
蛹虫草中含有蛹虫草菌素(cordycepin)、虫草多糖(cordycepicpolysaccharide)和虫草酸(cordycepicacid)等,是能提高人体免疫机能的生物活性物质。
蛹虫草是由子座与菌核(即虫或蛹的尸体部分)两部分组成的复合体。
其无性型为蛹草拟青霉(Paecilomycesmilitaris)。
菌丝体生长和子实体生长属于蛹虫草生活史的有性阶段[3-6]。
在适宜环境条件下,经各种方式侵染鳞翅目、鞘翅目和双翅目等昆虫幼虫、蛹或成虫体内的蛹草拟青霉孢子,会萌发形成菌丝体,利用昆虫体内的营养物质促进其生长发育和分化,直至菌丝体将其分解完毕,此时生殖生长取代营养生长,菌丝体逐渐扭结分化形成菌核并穿出昆虫体外成为真菌子座(子实体),最终成熟形成一种真菌与虫体的虫菌结合体,真菌子座的顶部含有子囊,子囊内有孢子,当子囊成熟时,孢子会再次散出侵染昆虫。
其分布广泛,在我国东北、华北、西南的针叶林地、阔叶林地或混交林地、山地均有蛹虫草生长。
1.2蛹虫草液体发酵的研究现状
虫草素作为蛹虫草最为重要的生理活性物质,其应用价值也引起了人们越来越多的重视,并对其生产方法进行大量研究,为满足市场需求,目前主要有三条途径获得高产虫草素:
一是直接从蛹虫草子实体中提取,二是通过化学方法人工合成,三是进行液体发酵,再从其菌丝体和发酵液中提取。
其中液体发酵在生产中被广泛应用,不仅因为蛹虫草液体发酵法获得的菌丝体及发酵液的化学组成与子实体接近,而且培养周期短、发酵条件易控制、活性物质易于提取以及更易于大规模工业化生产等优点造就了液体发酵方法独特的优势。
蛹虫草液体发酵中菌丝体的生长和其代谢产物的产生与其培养基的配方及发酵条件的控制有着直接关系,大量研究主要围绕蛹虫草高产菌株的筛选、培养基成分的优化(碳氮源、无机离子)、培养条件(pH、溶氧、温度)、外源添加物(多糖、嘌呤)等方式来提高其菌丝体及代谢产物产量,并取得显著成效。
Das采用离子光束辐照处理出发菌株获得虫草素高产菌株,以86.2g/L葡萄糖作为碳源,93.8g/L酵母膏作为氮源,液体培养该高产突变株获得的虫草素产量为6.84g/L,是出发菌株的2.79倍还多[7]。
Shih和Tsai研究了初始pH值、不同氮源、不同培养方式等对蛹虫草培养过程中生物量、腺苷和虫草素等产量的影响,得出虫草素合成的最优培养条件为:
pH值为6,酵母浓度为45g/L,摇瓶培养8天,然后静态培养16天,虫草素的最大产量达到了2.2g/L[8]。
张红霞认为不同的pH值对发酵液中的虫草素和腺苷含量的影响具有一定的差异,在pH值4~9时,虫草素含量呈快速上升趋势,而在pH值9~10时呈下降趋势,其中pH值为9时发酵液中的虫草素含量为最高值。
荆留萍研究添加了8种前体营养物对蛹虫草液体发酵产虫草素及多糖的影响,发现腺苷、核糖、谷氨酰胺、甘氨酸均能促进虫草素和多糖的合成,当腺苷添加量为4.0mg/mL时,虫草素含量达2.7mg/g[9]。
有研究表明,含氮类化合物对虫草素的代谢有明显作用,毛先兵通过合成培养基考察25种含氮化合物对蛹虫草液体发酵中虫草素合成的影响,结果表明NH4+最有利于虫草素合成[10]。
Mao等人同样证实铵离子对蛹虫草的次级代谢物虫草素及其类似物合成有明显的促进作用[11]。
大豆富含优质蛋白质、大豆异黄酮、低聚糖、皂苷、亚油酸、亚麻酸、磷脂和食物纤维素等多种营养保健成分,且通过微生物发酵产生的二次加工产物具有更强的生理活性功能,更提高了其的附加值。
目前对虫草菌接种于大豆进行发酵的研究还很少,有研究表明,黄豆不仅能促进蛹虫草菌的生长,还能促进产生更多的生理活性物质,如虫草素等[12]。
若以物美价廉的黄豆替代高价位的腺苷核糖等含氮类添加物作为蛹虫草的培养基质,利用蛹虫草通过液体发酵黄豆粉进行生物转化,以获得高虫草素含量的发酵液。
1.3功能性饮料的研究现状
由于现代化生活的改善,消费者不仅注重物质上的食粮,更是把精神食粮提上了日程,不仅要喝的过瘾,更要喝得健康,口味自然是越来越高。
功能性饮料即是指把一些具有天然营养素的物质通过一定量的配比和改善,从而得到对人体具有调节作用的功能性饮料。
大多数功能性饮料均含有多种人体必需氨基酸、人体免疫功能成分、抗氧化物质、矿物质以及各种维生素等[52]。
全球功能性饮料基本上是由运动饮料、能量饮料、抗氧化饮料、人体免疫功能饮料和其他类型功能饮料构成。
功能性饮料的生产主要靠三方面技术:
一是发酵技术,如酸奶生产中乳杆菌、双歧杆菌等益生菌的应用;二是生理活性物质分离提取技术,如利用超临界提取、色谱技术等将活性物质提取出来再添加至饮料中加以应用;三是为改善口感、消化吸收性、吸水性、流变学特性等做的纳米化处理技术,主要应用于饮料中的膳食纤维的处理。
其中发酵及添加新型活性物质的方式更受市场青睐。
目前,利用蛹虫草菌开发的功能性饮料产品有很多,主要以蛹虫草浸提液或蛹虫草发酵液配制而成。
张城将蛹虫草发酵液与枸杞红枣金银花的提取液进行调配,制得蛹虫草复合饮料[13],孙连海用蛹虫草浸提液与原料乳混合研制了蛹虫草发酵乳饮料[14],鲁璐,辛晓艳通过蛹虫草发酵液添加酸味剂和麦芽糊精调配出蛹虫草发酵饮料[15],朱蕴兰、周卫东用的蛹虫草发酵液调配蛹虫草酸奶饮料[16]等。
用蛹虫草发酵液调配的饮料基本是利用PDA培养基制备或SDAY培养基获得的蛹虫草发酵液。
而利用蛹虫草直接对天然作物等原料进行液体发酵制备饮料却鲜见报道。
若通过上述高虫草素含量的黄豆粉发酵液为主要原料制备新型蛹虫草饮料产品,不仅为农产品深加工开辟了新途径,还为大众提供了廉价却有类似冬虫夏草功能新型饮料。
本论文研究的蛹虫草黄豆粉发酵饮料就是通过蛹虫草菌对黄豆粉进行液体发酵,产生以虫草素为主的多种生理活性物质,再以发酵液为主要原料调配新型的功能性饮料。
由于生长地理条件的特殊要求及严格的寄生特性,使得野生虫草资源越来越稀缺。
目前,国内外医药保健品原材料市场对虫草的需求旺盛。
蛹虫草真菌作为我国一种珍贵的传统药用真菌,其药理特性已得到广泛的证实,特别是活性成分虫草素也更受到广泛关注。
人工培养的蛹虫草化学成分、药理作用与冬虫夏草基本相同,可以作为冬虫夏草的代用品。
以物美价廉的黄豆粉作为新的培养基质,接种蛹虫草进行液体发酵,以产生高虫草素含量的发酵液,并以此为主要原料开发新型功能性饮料,不仅为农作物深加工利用开辟新途径,且为人民大众提供了有与冬虫夏草同样保健效果的新型廉价功能性饮品。
1.4研究目的及意义
本研究对小鼠饲喂不同剂量的蛹虫草黄豆粉发酵饮料,分别以小鼠免疫器官以及血清和肝脏组织中免疫球蛋白G(IgG),免疫球蛋白M(IgM),白细胞介素4(IL-4)以及γ-干扰素(IFN-γ)为指标,研究蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠的免疫活性,为蛹虫草发酵饮料的开发等方面的研究提供重要的理论根据。
2材料与方法
2.1材料与试剂
蛹虫草黄豆粉发酵饮料,自制;
2.1.1蛹虫草豆粉发酵液的制备工艺流程
蛹虫草豆粉发酵液制备工艺流程如下:
保藏菌株→菌株活化→种子液培养
↓
豆粉培养基→灭菌→接种→暗室培养→过滤→蛹虫草豆粉发酵液
2.1.2菌株的活化
将实验室保藏的蛹虫草菌种接种于斜面培养基进行活化,在22℃培养7~8d。
2.1.3种子液的制备
将斜面菌种接种至液体种子培养基中,于22℃,转速120rpm条件下避光振荡培养4d。
分别以黄豆、黑豆、豌豆、花豇豆作不同豆粉液体培养基,浓度1%,接种量10%,转速120rpm,22℃培养7天,以发酵液中虫草素含量为指标,确定最佳的豆类品种;将黄豆粉浓度分别定为0.5%、1.0%、1.5%、2%和3%,接种量10%,转速120rpm,22℃培养7天,以发酵液中虫草素含量为指标,确定黄豆粉最佳的添加浓度。
将接种量分别设定为5%、10%、15%、20%和25%,浓度1%,转速120rpm,22℃培养7天,以发酵液中虫草素含量为指标,确定最佳的接种量。
将转速分别设定为100rpm、120rpm、140rpm和160rpm,浓度为1%,接种量20%,22℃培养7d,以发酵液中虫草素含量为指标,确定最佳的发酵时间。
将培养时间分别设定为1d、3d、5d、7d和9d,浓度1%,接种量20%,转速120rpm,22℃培养,以发酵液中虫草素含量为指标,确定最佳的发酵时间。
豆类品种、浓度、接种量、转速、发酵时间等因素均能影响蛹虫草豆粉发酵液中虫草素的含量,以此确定蛹虫草豆粉发酵液制备的最佳条件:
最佳发酵豆类为黄豆,黄豆粉浓度为1.0%,接种量为20%,转速为120rpm,发酵时间为7d。
在最适条件下制备的蛹虫草黄豆粉发酵液中虫草素含量为12.6mg/g。
2.1.4蛹虫草黄豆粉发酵饮料制备工艺流程
蛹虫草黄豆粉发酵饮料制备工艺流程如下:
蛹虫草黄豆粉发酵液→过滤→均质→灌装→灭菌→冷却→成品
↑
蔗糖、柠檬酸、麦芽糊精
蛹虫草自身具有特殊清香微苦的味道,饮料中发酵液的含量会直接影响饮料口感。
分别在蛹虫草黄豆粉发酵饮料中添加30%、40%、50%、60%、70%的发酵液,考察饮料的综合感官评价,确定最佳的发酵液添加量。
分别在蛹虫草黄豆粉发酵饮料中添加2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL、5g/100mL、6g/100mL的蔗糖调节口感,考察饮料的综合感官评价,确定最佳蔗糖添加量。
分别在蛹虫草黄豆粉发酵饮料中添加0.05g/100mL、0.07g/100mL、0.09g/100mL、0.11g/100mL、0.13g/100mL的柠檬酸调味,考察饮料综合感官评价,确定最佳柠檬酸添加量。
麦芽糊精是一种良好的稳定剂,能保持原产品的特色和香味,使产品口感醇厚、细腻,味香浓郁,稳定性好,不易沉淀。
分别在蛹虫草黄豆粉发酵饮料中添加3g/100mL、4g/100mL、5g/100mL、6g/100mL、7g/100mL的麦芽糊精作为稳定剂,考察饮料的综合感官评价,确定最佳麦芽糊精添加量。
发酵液添加量、蔗糖添加量、柠檬酸添加量、麦芽糊精添加量单因素实验基础上,通过正交实验确定蛹虫草黄豆粉发酵饮料最佳工艺条件:
发酵液添加量40%,蔗糖添加量4%,柠檬酸添加量0.07%,麦芽糊精添加量3%。
此条件下饮料中,虫草素含量达53µg/mL。
蛹虫草黄豆粉发酵饮料为淡黄色,澄清透明,虫草香味协调,风味独特,饮后舒适,符合国家饮料的理化、卫生、感官指标,符合滋补饮料营养、功能化的发展趋势。
昆明种清洁级8周龄小鼠,购自山东鲁抗医药股份有限公司;
香菇多糖片,购自湖北广仁药业有限公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,免疫球蛋白G(IgG)小鼠ELISA检测试剂盒,免疫球蛋白M(IgM)小鼠ELISA检测试剂盒,白细胞介素4(IL-4)小鼠ELISA检测试剂盒、γ-干扰素(IFN-γ)小鼠ELISA检测试剂盒,购自南京建成生物工程公司
基础饲料,购自自山东鲁抗医药股份有限公司;
混合饲料,考虑小鼠对蛹虫草黄豆粉发酵饮料灌胃量的承受能力,选择将饮料干粉混入饲料,对小鼠进行饲喂以达到摄入饮料成分的效果。
将分别含虫草素10、20、30mg/kgbw蛹虫草黄豆粉发酵饮料干粉(其剂量相当于人体推荐用量的10、20和30倍)混入基础饲料中,作为免疫试验饲喂小鼠的低、中、高剂量的混合饲料。
2.2设备与仪器
ELx808型酶标仪美国BioTek公司
WFZUV-2000紫外分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司
TGL-16M高速台式冷冻离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司
AR1140型电子分析天平奥豪斯国际贸易(上海)有限公司
高速多功能粉碎机浙江省永康市红太阳机电有限公司
2.3实验方法
2.3.1小鼠的饲喂
对鼠房、鼠粮、垫料、鼠笼和小鼠的准备。
对鼠房按(7g高锰酸钾+14mL甲醛溶液)/m³熏蒸灭菌24h,通风7天。
柱形基础日粮(购买),粉末基础日粮(混有发酵液饮料冻干样品,加适量蒸馏水制成条状,55℃烘干),高脂饲料(普通饲料88.8%,猪油10%,胆固醇1%,胆盐0.2%),垫料(喷洒新洁尔灭消毒剂,晒干)。
鼠笼需放入5%的84消毒液浸泡1h,取出晾干备用。
选取50只初始体重18~22g的8周龄昆明种清洁级雄性小鼠,随机分为5个处理组,分别为空白组,香菇多糖阳性组(10mg/kgbw),低、中、高剂量组,每组10只。
空白组和香菇多糖阳性组饲喂基础饲料,低、中、高剂量组分别饲喂低、中、高剂量的混合饲料。
香菇多糖阳性组小鼠灌胃香菇多糖溶液,空白组和低、中、高剂量组灌胃同体积的生理盐水。
实验小鼠饲养温度为18~22℃,自然光照,自由采食和饮水。
每天开窗通风,上午进行灌胃,并记录小鼠体重,观察小鼠的状态,下午喂食,每隔2天换一次垫料,连续6周,保持鼠房湿度60%左右。
宰杀前一天停止喂食,只喂水,记录小鼠最终体重。
2.3.2血浆的制备
实验小鼠末次灌胃、注射后,禁食12h,摘眼球取血,收集血液,每份血液用40单位的肝素钠抗凝,静置3h,3000rpm离心15min,小心吸取上层血浆,分装后液氮冷冻备用。
2.3.3肝脏匀浆的制备
解剖小鼠取肝脏,用4℃生理盐水洗净(去除表面残留的血液和污物),滤纸吸干,剪取0.2g左右肝脏组织,放入微量组织匀浆器中,加入9倍生理盐水,研磨完全,制成10%肝脏组织匀浆。
图2-3-4不同组别小鼠脾脏实图
Table2-3-4Differentgroupsofmiceliverthereare800,000monographs
如图2-3-4所示:
正上方:
空白组(饲料:
普通日粮灌胃:
生理盐水);左上方:
阳性对照组(饲料:
普通日粮灌胃:
香菇多糖片(10mg/kgbw));右上方:
低剂量组(饲料:
低剂量的混合饲料灌胃:
生理盐水);左下方:
中剂量组(饲料:
中剂量的混合饲料灌胃:
生理盐水);右下方:
高剂量组(饲料:
高剂量的混合饲料灌胃:
生理盐水);。
从图中,可以看出空白组和香菇多糖阳性对照组的小鼠肝脏颜色较淡,而饲喂低、中、高剂量组的小鼠肝脏颜色较深。
2.3.4蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫器官指数的影响
所有实验小鼠饲养42d,实验结束之前进行称重,分别获取免疫器官(胸腺和脾脏)并称重,计算免疫器官指数(以g/kg体重表示)。
2.3.5蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆中免疫功能指标的影响
小鼠血浆中免疫功能指标免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素4(IL-4)及γ-干扰素(IFN-γ)的测定均采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkimmunosorbentassay,ELISA),使用ELISA检测试剂盒,并严格按照说明书提供方法和步骤进行。
2.3.6蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠肝脏组织匀浆中免疫功能指标的影响
小鼠肝脏组织匀浆中免疫功能指标免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素4(IL-4)及γ-干扰素(IFN-γ)的测定均采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkimmunosorbentassay,ELISA),使用ELISA检测试剂盒,并严格按照说明书提供方法和步骤进行。
3数据处理与分析
数据采用
±s来表示,组间比较采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和差异显著分析。
3.1蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫器官指数的影响
表3.1蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫器官指数的影响
Table3.1EffectsoffermentedsoybeanbeveragewithCordycepsmilitaris
ontheimmuneorgansindexofmice
组别
胸腺指数(g/kg体重)
脾脏指数(g/kg体重)
空白组
1.84±0.27b
3.94±0.13b
阳性对照组(香菇多糖)
2.39±0.13a,b
4.28±0.37a,b
低剂量组
1.96±0.28a,b
4.15±0.16a,b
中剂量组
2.20±0.16a,b
4.55±0.18a,b
高剂量组
2.55±0.29a
4.80±0.20a
注:
相同字母代表差异性不显著,不同字母代表差异性显著(P<0.05)
胸腺指数、脾脏指数是直接反映机体免疫状况的重要参数。
由图3-1可知,与空白组相比,随着蛹虫草黄豆粉发酵饮料剂量的增加,小鼠的胸腺指数和脾脏指数都相应增加,高剂量组小鼠的胸腺指数和脾脏指数显著性提高(P<0.05)。
高剂量下小鼠的胸腺和脾脏指数分别提高38.59%和21.83%。
3.2蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠血浆和肝脏中IgG含量的影响
表3.2蛹虫草黄豆粉发酵液对小鼠血浆和肝脏中IgG含量的影响
Table3.2EffectsoffermentedsoybeanbeveragewithCordycepsmilitaris
ontheplasmaandlivertissueIgGconcentrationsinmice
组别
血浆(mg/mL)
肝脏(mg
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