第三章分子克隆载体Molecular cloning vectors.docx
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第三章分子克隆载体Molecularcloningvectors
第三章 分子克隆载体(Molecularcloningvectors)
[本章摘要]
将外源DNA或基因携带入宿主细胞(hostcell)的工具称为载体,载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体,也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有:
pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体,如:
pBluescriptⅡKS(±)。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态,有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI基因失活以及Spi筛选等选择标记,分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有:
λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell载体等。
常见的置换型载体有:
EMBL3/4及其类似载体,λgem-11载体。
粘粒是带有cos序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有:
pJB8、pcos1EMBL以及卡隆9载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难,注意用对应的方法解决。
M13噬菌体是一种单链噬菌体,基于其构建的载体可以制备单链DNA。
常见的M13噬菌体载体有M13mp18/19,其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒,噬菌粒工作的时候需要M13K07辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
YAC是基于酵母染色体生物学性质构建的载体,BAC是基于F质粒的生物学性质构建的载体,PAC是基于P1噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体,可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合位点等。
穿梭载体和整合载体在基因操作中也扮演着重要的角色。
第一节质粒载体
一、质粒的基本特性
1.质粒的复制
通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区(整个遗传单位定义为复制子)。
在不同的质粒中,复制起始区的组成方式是不同的,有的可决定复制的方式,如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。
图3-1是其复制其始示意图。
在复制时,首先合成前RNAⅡ,即前引物,并与DNA形成杂交体;而后RNaseH切割前RNAⅡ,使之成为成熟的RNAⅡ,并形成三叶草二级结构,该引物引导质粒的复制。
形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构,同时Rop增强RNAⅠ的作用,从而控制质粒的拷贝数。
削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变,将增加带有pMB1或(ColE1)复制子的拷贝数。
图3-1带pMB1(或ColE1)复制起点的质粒在复
制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2.质粒的拷贝数
质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限,大约1~几个;松驰型质粒拷贝数较多,可达几百。
表5-1就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表3-1:
质粒载体及其拷贝数
质粒
复制子
拷贝数
pBR322及其衍生质粒
pMB1
15~20
pUC系列质粒及其衍生质粒
突变的pMB1
500~700
pACYC及其衍生质粒
p15A
10~212
pSC101及其衍生质粒
pSC101
~5
ColE1
ColE1
15~20
pUC系列质粒的复制单位来自质粒pMB1,但其拷贝数较高。
pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白,而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶(DNA聚合酶Ⅰ,DNA聚合酶Ⅲ),依赖于DNA的RNA聚合酶,以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的产物。
因此,存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时,带有pMB1(或ColE1)复制子的质粒将继续复制,最后每个细胞中可积聚2~3千个质粒。
3.质粒的不相容性
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性,它是指在第二个质粒导入后,在不涉及DNA限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统,从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时,在分配到子细胞的过程中会竞争,随机挑选,微小的差异最终被放大,从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体,一般具有相同的复制子。
在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群,如ColE1和pMB1,pSC101和p15A。
4.转移性
质粒具转移性。
它是指在自然条件下,很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因mob,转移基因tra,顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。
二、标记基因
按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。
选择标记用于鉴别目标DNA(载体)的存在,将成功转化了载体的宿主挑选出来,筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来。
(一)选择标记
抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。
1.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistancegene,ampr)
氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记,绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。
青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成,与有关的酶结合并抑制其活性,抑制转肽反应。
氨苄青霉素抗性基因编码一个酶,该酶可分泌进入细菌的周质区,抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解,从而解除了氨苄青霉素的毒性。
青霉素是一类化合物的总称,其分子结构由侧链R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸(6-APA)两部分组成。
在6-APA中有一个饱和的噻唑环(A)和一个β-内酰胺环,6-APA为由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽。
2.四环素抗性基因(Tetracyclineresistancegene,tetr)
四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。
四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。
pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外,还带有四环素抗性基因。
3.氯霉素抗性基因(chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat)
氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。
目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体(也携带Tn9)。
cat基因编码氯霉素乙酰转移酶,一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基23kDa)。
在乙酰辅酶A存在的条件下,该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物,使之不能与核糖体结合。
4.卡那霉素和新霉素抗性基因(kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor)
卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷,都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。
卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3')-Ⅱ,25kDa)的基因,氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化,从而干扰了它们向细胞内的主动转移。
在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔,保护宿主不受这些抗生素的影响。
5.琥珀突变抑制基因supF
在基因的编码区中,若某个密码子发生突变后变成终止密码子,则称这样的突变为赭石突变(突变为UAA),或琥珀突变(突变为UAG),或乳白突变(突变为UGA)。
supF基因编码细菌的抑制性tRNA,可在UAG密码子上编译酪氨酸。
如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr基因和ampr基因,只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。
相应的,supE基因在UAG密码子上编译谷氨酰氨。
由于目前所用的标记基因使用方便,因此用这类标记的载体较少。
6.其它
还有一些正向选择标记,表达一种使某些宿主菌致死的基因产物,而含有外源基因片段插入后,该基因便失活。
如蔗糖致死基因SacB,来自淀粉水解芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),编码果聚糖蔗糖酶。
在含蔗糖的培养基上sacB基因的表达对大肠杆菌来说是致死的,因此该基因可用于插入失活筛选重组子。
(二)筛选标记
筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒,当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。
1.α-互补(α-complementation)
α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,由1024个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶,如果lacZ基因发生突变,则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。
例如,lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因,无酶学活性。
对于只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因(称为lacZ'),其产物也没有酶学活性。
但这两个无酶学活性的产物混合在一起时,可恢复β-半乳糖苷酶的活性,实现基因内互补。
在lacZ'编码区上游插入一小段DNA片段(如51个碱基对的多克隆位点),不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。
但是,若在该DNA小片段中再插入一个片段,将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。
利用这一互补性质,可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。
在相应的载体系统中,lacZ△M15放在F质粒上,随宿主传代;lacZ'放在载体上,作为筛选标记(图3-2)。
相应的受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue,前二者均带有D(lac-proAB)F'[proAB+lacIqlacZDM15]基因型。
其中lacI为lac阻抑物的编码基因,lacIq突变使阻抑物产量增加,防止lacZ基因渗漏表达。
lacZ基因是乳糖lac操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因,乳糖及其衍生物可诱导其表达。
乳糖既是lac操纵子的诱导物,也是作用的底物。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是乳糖的衍生物,可作为lac操纵子的诱导物,但不能作为反应的底物;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)可作为lac操纵子的底物,但不能作为诱导物。
底物X-gal还可充作生色剂,被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物,可使菌落或噬菌斑呈兰色。
2.插入失活
通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322,该质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)两种抗性标记。
当外源DNA片段插入tetr基因后,导致tetr基因失活,变成只对氨苄青霉素有抗性。
这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
三、质粒载体的种类
(一)克隆载体
克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段,是最简单的载体。
1.pBR322
pBR322质粒的大小为4361bp,GenBank注册号为V0lll9和J01749,含有30多个单一位点,具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr),其质粒复制区来自pMB1(如图3-3)。
目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。
利用四环素抗性基因内部的BamHⅠ位点来插入外源DNA片段,可通过插入失活进行筛选。
2.pUC18和pUC19
pUC18和pUC19大小只有2686bp,是最常用的质粒载体,其结构组成紧凑,几乎不含多余的DNA片段,GenBank注册号为L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。
由pBR322改造而来,其中lacZ(MSC)来自M13mp18/19图3-4是其质粒图谱。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的,只是多克隆位点的排列方向相反。
这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因,因此其拷贝数达500-700。
pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列,在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。
因此在多克隆位点中插入了外源片段后,可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
图3-4:
pUC18/19质粒图谱
3.pUC118和pUC119
由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来,大小为3162bp,GenBank注册号为U07649(pUC118)和U07650(pUC119)。
相当于在pUC18/19中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
4.pGEM-3Z/4Z
pGEM-3Z/4Z由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来,大小为2.74kb,GenBank注册号为X65304(pGEM-3Z,2743bp)和X65305(pGEM-4Z,2746)。
与pUC18/19相比,在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子,如Sp6和T7噬菌体的启动子。
pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。
5.多功能质粒载体
在上述载体的基础上,人们设计出一些多功能的质粒载体,这类质粒载体综合了以上质粒的特点。
除了作为质粒载体基本要素外,综合了上述功能要素,如多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。
典型的这类质粒有pBluescriptⅡKS(±),这类质粒一般由4个质粒组成一套系统,其差别在于多克隆位点方向相反(根据多克隆位点两端KpnⅠ和SacⅠ的顺序,用KS或SK表示),或单链噬菌体的复制启始方向相反(或者说,引导DNA双链中不同链合成单链DNA,用+或-表示),pBluescriptⅡKS(+)的GenBank注册号为X52327。
pBluescriptⅡKS(±)的多克隆位点与pUC18/19的不同,且使用f1噬菌体的复制与包装信号序列,质粒图谱如图3-5。
6.表达载体
该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的,主要增添了强启动子,以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件,详细情况见本章第六节。
第二节λ噬菌体载体(λphagevectors)
一、λ噬菌体的分子生物学
λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体,在感染宿主后可进入溶源状态,也可进入裂解循环。
λ噬菌体基因组为长度约为50kb的双链DNA分子,实际大小为48502bp(GenBank注册号为:
J02459或M17233)。
图5-8是λ噬菌体的结构示意图。
在噬菌体颗粒内,基因组DNA呈线性,其两端的5'末端带有12个碱基的互补单链(粘性末端),12个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。
当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后,其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子,而后在宿主细胞的DNA连接酶和旋促酶(gyrase)作用下,形成封闭的环状DNA分子,充当转录的模板。
此时,λ噬菌体可选择进入裂解生长状态(lyticgrowth),大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒,导致宿主细胞裂解。
经过40~45min的生长循环,释放出约100个感染性噬菌体颗粒(每个细胞);或者进入溶源状态(lysogenicstate),将λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中,并随宿主的繁殖传给子代细胞。
λ噬菌体生活史简见图3-6。
λ噬菌体基因组至少可编码30个基因,它们的分布和排列与其功能有一定关系(图3-7)。
根据执行功能的不同可将基因组分为三个区。
左边区域包括从基因Nu1到基因J之间的基因,其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的形成。
中间区域(基因J右边至gam)编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。
其中许多基因对裂解生长是非必须的,在构建载体时可以去掉,用外源DNA片段替代。
右边区域(基因gam右边至基因Rz)包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。
(一)λ噬菌体发育调节
1.吸附(adsorption)
2.立即早期转录(immediateearlytranscription)
3.延迟早期转录(delayedearlytranscription)
4.溶源和裂解的感染分化
在延迟早期结束时,对于进入下一步生长所需的蛋白才会表达出来,从而导致生长方式不可逆地朝着裂解循环或溶源循环方向发展。
对野生型大肠杆菌来说,向溶源和裂解方向的转变是由感染复数(multiplicityofinfection)和细胞的营养状态决定的。
感染复数越高,营养状态越差,溶源化(lysogenization)的频率就越高。
溶源现象的生化媒介可能是3'-5'cAMP,它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变。
另外一个重要的调节因素是噬菌体的CⅡ蛋白,它是噬菌体基因转录的激活子,抑制裂解功能基因的表达,催化噬菌体DNA整合到细菌的染色体中去。
高浓度的CⅡ蛋白促进溶源化,而低浓度CⅡ蛋白促进裂解生长。
CⅡ蛋白还可协助调节PRE、PI和PaQ三个启动子向左转录,分别控制基因cⅠ和基因int的表达,以及指导减少基因Q(抗终止子)表达的反意RNA的合成。
当CⅡ蛋白浓度足够时,激活基因cⅠ和基因int的表达,导致噬菌体DNA整合到宿主的染色体上。
5.进入裂解生长
基因O和P在立即早期转录过程中的转录是微弱的,但在蛋白N介导的抗终止作用下转录活性变的更强。
在感染早期,利用蛋白O和P激活的单一复制起点,在宿主的复制蛋白和应激蛋白(stressproteins)的作用下,噬菌体DNA通过θ方式进行复制。
在野生型λ噬菌体感染的野生型大肠杆菌中,大约合成50个噬菌体基因组单体后进入滚环复制。
通过复制产生基因组DNA的多联体(concatemer),最后被切割并被包装到噬菌体颗粒中。
图3-8是包装λ噬菌体的过程。
6.溶源化
λ噬菌体感染野生型大肠杆菌后,只有一部分细胞进入裂解循环。
相反,在大多数感染的细胞群体中,裂解循环是受挫的,存活的细胞进入溶源状态。
在噬菌体的整合酶Int(integrase)和宿主的整合宿主因子IHF作用下,噬菌体DNA通过其上唯一整合位点attP与宿主染色体DNA上的唯一整合位点attB发生重组,从而整合到染色体中。
整合酶Int是Ⅰ型拓扑异构酶,可同时切割和连接DNA,对含负超螺旋的闭合环状DNA的作用效果更好。
attP位点是噬菌体DNA上一个约240bp的序列,其中含有一个与宿主染色体完全相同的15bp核心区。
attB位点是宿主染色体上的一个21bp长含有核心区的序列。
在整合过程中这两个位点之间发生同源重组,使噬菌体DNA整合到染色体中形成原噬菌体,并在原噬菌体两端形成attL位点和attR位点,同时在这两个位点外侧还有一对15bp的正向重复序列。
在物理或化学因素的刺激下,原噬菌体可从宿主染色体上切离(excision)出来。
原噬菌体切离时,在这些重复序列之间发生同源重组,恢复attP位点和attB位点。
(二)λ噬菌体的可取代区
在溶源状态,λ噬菌体DNA整合在半乳糖代谢基因gal和生物素合成基因bio之间。
λ噬菌体在某些条件下,会从宿主染色体上切离出来,进入裂解循环。
切离和整合是相互对立的过程,在不同重组酶的作用下,导致切离或整合的发生。
溶源化λ在切离时,可能产生不正确切离,从而产生不正常λ噬菌体,即缺陷型λ噬菌体。
在这些缺陷型λ噬菌体中,λ噬菌体丢失了一部分基因组DNA,同时获得了一部分宿主的DNA。
通过分析大量缺陷型λ噬菌体的DNA,发现J基因与Cro基因之间的DNA被ga1基因或bio基因替换后,不影响λ噬菌体裂解生长。
这个区段约占λ噬菌体DNA的1/3,主要包含控制λ噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。
60%区域为裂解生长所必须的,其中在左臂约20kb,含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因,即从基因A至基因J的区域;右臂约为8-10kb,从PR启动子到右侧cos位点。
二、λ噬菌体的选择标记
1.基因组大小
λ噬菌体的遗传学研究发现,重组λ噬菌体的基因组DNA太大或太小会影响其存活能力。
当基因组DNA长度为野生型λ噬菌体基因组DNA的78~105%时,不会明显影响存活能力。
野生型λ噬菌体基因组DNA为48kb,若用外源DNA片段完全替换可取代区,外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。
2.lacZ基因
lacZ基因也可用于λ噬菌体载体,通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段,在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色,筛选重组噬菌体。
3.基因cⅠ失活
基因cⅠ是λ噬菌体的抑制基因,全面抑制并阻断基因的表达,与操纵区oR和oL结合。
cⅠ基因的表达促进λ噬菌体进入溶源状态,基因cⅠ产物活性受到影响会促进λ噬菌体进入裂解循环。
在带有hfl(高频溶源化,highfrequencyoflysogenization)的E.coli中,λ噬菌体可高效率地进入溶源状态。
在hfl突变E.coli中,基因cⅡ产物可以累积到较高水平。
基因cⅡ产物为基因cⅠ的正调节物,因此hfl突变可增加基因cⅠ的产物,从而使裂解生长受到抑制,高效地进入溶源状态。
如果外源DNA片段插入基因cⅠ中,将高频率地使hfl突变E.c
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