安农大2012-2013《食品生物技术》复习资料文档格式.doc
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了解近年来基因工程的进展。
(1)定义:
基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质(基因)分离出来,在体外进行剪切、拼接、重组,形成基因重组体,然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达,最终获得人们所需要的基因产物。
(人们按照自身的意愿,进行严密的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,有目的地改造生物种性,使现有的物种在较短时间内趋于完善,创造出更符合人们需求的新的生物类型,这就是基因工程。
)
(2)步骤:
①获取目的基因:
在供体细胞中用限制性内切酶切割基因,以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体(质粒、病毒或噬菌体);
②构建重组体:
把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体;
③把重组体引入宿主细胞;
④筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。
(切、接、贴、检查修复)
(3)进展:
基因工程的发展经历了前期的准备阶段、基因工程的诞生、基因工程的快速发展几个阶段。
基因工程的迅速发展阶段:
近20年是基因工程迅速发展的阶段。
在基因工程基础研究方面,开发了大量的基因操作技术,开发了多种供转化的原核生物和动物、植物细胞载体,并获得了大量的转基因生物。
基因工程基础研究的进展,推动了基因工程应用的迅速发展。
用基因工程技术研制的贵重药物,至今已上市的有50种左右,上百种药物正在进行临床试验,更多的药物处于前期实验室研究阶段。
转基因植物的研究也有很大的进展,自从1986年首次批准转基因烟草进行田间试验以来,至1998年4月全世界批准进行田间试验的转基因植物就达4387项。
转基因动物研究的发展虽不如转基因植物研究得那样快,但也已获得了转生长激素基因鱼、转生长素基因猪和抗猪瘟转基因猪等。
在农业上,基因工程发展速度势头强劲。
全球转基因作物种植面积一直在扩大。
13.简述反义基因技术的基本概念、原理及其特点,并熟悉反义基因技术在食品产业中的应用。
反义RNA是指有义DNA链转录成的、与特异的靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。
反义基因是转录产生反义RNA的基因。
反义RNA技术是把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间,然后把此基因构建体转化到受体细胞中去(通常用农杆菌转化的方法),通过选择培养获得转化生物体的技术。
(2)原理:
反义基因转录生成的mRNA可以抑制具有同源性的内源基因的表达,用这种方法可获得特定基因表达受阻而其他基因表达不受影响的转基因植株。
一般认为,在原核细胞中反义RNA与靶RNA具有特异互补性,通过碱基配对结合的方式在复制、转录、翻译等过程中对目的基因起着负调控作用,但详细的机理还不清楚。
(3)特点:
①反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达,不影响其他基因的表达。
反义基因的不同区段抑制效率不同,基因的部分片段(小至41bp)就可起到抑制效果,抑制程度理论上为0%~100%,这不同于基因的完全致死抑制,因此可从转基因个体中筛选到所需要的基因型。
②转化到植物中的反义RNA的作用类似于遗传上的缺陷型,表现为显性。
所以被转化的植物材料不必为纯合体就可表现相应的性状,从而避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。
③反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传,后代符合孟德尔遗传规律。
④反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构,可省去对基因产物的研究工作。
⑤反义基因不改变目的基因的结构,在应用上更加安全。
(4)应用:
将反义PG基因转入番茄得到耐贮运的番茄(P77),植物淀粉改良(P85),植物油脂改良(P87)。
14.简述利用生物技术的方法如何调控乙烯的生物合成。
如导入反义1-氨基环丙烷基羧酸(ACC)合酶基因;
导入反义ACC氧化酶基因;
导入正义细菌ACC脱氨酶基因;
导入正义噬菌体SAM水解酶基因。
乙烯合成转基因番茄中
乙烯合成抑制
蛋氨酸
SAM合成酶↓水解酶
SAM→S-腺苷+高丝氨酸
ACC合成酶↓←反义ACC合成酶基因
ACC脱氨酶
ACC→α-丁基酮酸+氨
ACC氧化酶↓←反义ACC氧化酶基因
C2H4
利用转基因技术抑制果实的乙烯合成
(1)途径:
Met蛋氨酸SAM合成酶SAMACC合成酶ACCACC氧化酶C2H4乙烯
(2)导入正义噬菌体SAM水解酶基因可以水解SAM从而中断乙烯的合成。
ACC合酶是乙烯生物合成的关键酶。
将反义ACC合酶基因导入番茄,使ACC合酶的mRNA的转录大大降低,就能够获得成熟受阻碍的反义ACC合酶cDNA转基因番茄植物,能抑制ACC合酶的表达,使ACC合成受阻,抑制乙烯合成。
ACC氧化酶又叫乙烯形成酶,也是乙烯生物合成途径中的关键酶。
导入反义ACC氧化酶基因,也可抑制ACC氧化酶的形成,从而使乙烯合成受阻。
第3章细胞工程与食品产业
1.什么是细胞工程?
简述它的基本原理和基本技术。
(1)细胞工程,也称细胞技术,是以细胞为基本单位,在离体条件下进行培养或人为的精细操作,使细胞在体外大规模地繁殖,使细胞的一些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而达到体外生产生物产品的目的。
(2)基本原理:
细胞的全能性,即一个与合子具有相同遗传内容的体细胞具有产生完整生物个体的潜在能力称为细胞的全能性。
(3)基本技术:
①无菌操作技术:
细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行,实验操作应在无菌室内进行。
无菌室应定期用紫外线或化学试剂消毒,实验前后还应各消毒一次。
无菌室外有间缓冲室;
超净工作台是最基本的实验设备,对生物材料进行彻底的消毒与除菌是实验成功的前提,实验所用的一切器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌。
②细胞培养技术:
细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。
③细胞融合技术:
两个或多个细胞相互接触后,其细胞膜发生分子重排,导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。
2.植物细胞培养的方法有哪些?
细胞生产次生代谢产物的策略有哪些?
(1)植物细胞培养已形成了多种方法,有单细胞的培养、原生质体培养;
有固体培养、液体培养(摇瓶悬浮培养、大规模悬浮培养)等。
较为完善的有:
①植物细胞悬浮培养(分批培养法、半连续培养法、连续培养法)。
②植物细胞固定化培养技术(固定化细胞培养,即把细胞固定在一种惰性基质,如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维膜上面或里面,细胞不能运动,而营养液可以在细胞间流动,供应其营养。
按照其支持物不同可以分为两大类:
包埋式固定化培养系统、附着式固定化培养系统)。
(2)①利用愈伤培养获取生长效率高的细胞系;
②筛选目标代谢物产量高的高产细胞系(a.突变细胞;
b.培养条件的优化);
③固定化培养细胞提高胞外代谢物和生物转化产物量;
④利用诱导子在短时间内提高产量;
⑤胞内代谢物渗出胞外,利于下游操作;
⑥从培养基中吸附代谢产物,防止反馈抑制;
⑦合适的生物反应器中大规模细胞培养。
5.简述动植物细胞工程在食品工业中的应用?
(1)植物细胞工程在食品工业的应用:
①利用植物细胞工程生产香料。
②利用植物细胞培养技术生产食品添加剂(色素——甜菜苷、甜味剂——甜菊苷、鲜味剂——5'
核苷酸和有关的酶、防腐剂——没食子酸乙酯、增稠剂——琼胶)。
③利用植物细胞培养技术生产天然食品。
④利用植物细胞培养技术生产植物药。
⑤利用植物细胞培养生产抗氧化剂。
(2)动物细胞工程的应用:
主要是指利用动物细胞大规模培养技术生产植物和微生物难于生产的具有特殊功能的蛋白质类物质。
①在疫苗生产上的应用:
疫苗是一种主要成分具有免疫原性的蛋白质。
它是利用动物细胞大规模培养技术生产的最成熟的一种产品。
②在干扰素生产上的应用:
干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质,其活性的发挥受细胞基因组的调节和控制,涉及RNA和蛋白质的合成。
干扰素分子只具有抑制病毒的作用而不能杀灭病毒。
③在单克隆抗体生产上的应用:
应用动物大规模培养技术生产单克隆抗体是一条经济、可靠的途径。
④在干细胞体外诱导分化的应用:
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
根据干细胞分化功能上的差异,干细胞可分为单能干细胞,多能干细胞,全能干细胞。
根据来源,干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞(ES细胞)。
胚胎干细胞最早是由埃文斯(Evans)和考夫曼(Kaufman)以及马丁(Martin)等1981年分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立的细胞系。
可以在细胞培养液中加入不同的分化因子,定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞或者神经细胞,甚至可以用它培养出器官。
首先,利用干细胞培养可以实现组织修复和器官再生。
再者,结合克隆技术创建病人特异性的胚胎干细胞可以克服移植免疫排斥反应。
干细胞技术还可用于基因治疗。
⑤在其他基因重组产品生产上的应用。
第4章蛋白质工程
1.什么是蛋白质工程?
与蛋白质工程相关的技术和研究方法有哪些?
通过生物技术对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造,以便获得更适合人类需要的蛋白质产品的技术。
(2)①M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术。
这种定点突变方法的基本原理是利用一种环状噬菌体M13,这种噬菌体DNA可以以单链的形式在宿主细胞外存活。
当它自身要繁殖时,就进入细胞中,把单链DNA变成双链DNA,进行DNA复制。
复制出的单链DNA被包装成噬菌体释放到细胞外。
1982年,佐勒和史密斯首先将要改造的蛋白质目的基因重组到M13单链DNA中,以这种重组后的带有目的基因的M13单链DNA为模板,再人工合成一段寡聚核苷酸(其中包含了所要改变的碱基)作为引物,在体外进行双链DNA的合成。
这样合成的双链DNA,其中一条为含有天然目的基因的模板,而另一条单链则为新合成的含有突变目的基因的DNA链,因为它是以那段带有突变碱基的寡核苷酸为引物合成的。
这种杂合DNA双链再转入大肠杆菌中,分别以这两种不同的单链DNA为模板,进行DNA复制。
复制出的M13双链DNA,其中一半将含有已突变的目的基因。
利用DNA杂交技术或核苷酸序列分析方法,将含突变目的基因的M13噬菌体筛选出来,提取它们的DNA,用限制性内切酶把突变目的基因切下,并重组到表达质粒中,进行突变基因的表达。
这样就可以定向得到突变体蛋白了。
②寡核苷酸介导的PCR诱变技术。
随着PCR技术的成熟,定点诱变技术中也采用了PCR技术。
利用PCR进行定点诱变,可以使突变体大量扩增,同时提高诱变率。
③随机诱变技术。
随机诱变简单地说就是在突变位置上随机地引入一种突变。
④盒式突变技术。
1985年由Wells提出的一种基因修饰技术,它可以经过一次修饰,在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体,从而可以对蛋白质分子中某些重要氨基酸进行“饱和性”分析,大大缩短了误试分析的时间,加快了蛋白质工程研究的速度。
(3)蛋白质工程研究中主要采用的基因突变方法包括基因定位突变和盒式突变。
一般含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术、寡核苷酸介导的PCR诱变技术、随机诱变技术和盒式突变技术,而大面积的定位突变则需要采用基因全合成的方法。
3.阐述蛋白质工程技术在设计和改造新型蛋白质方面的主要步骤。
(1)蛋白质工程的基本步骤:
①分离纯化目的蛋白,使之结晶并作X晶体衍射分析,结合核磁共振等其他方法的分析结果,得到空间结构的尽可能多的信息;
②对目的蛋白的功能作详尽的研究,确定它的功能域;
③通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系的分析,找出关键的基因和结构;
④围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案,并用基因工程的方法去实施;
⑤对经过改造的蛋白质进行功能性测定,看看改造的效果如何;
⑥重复④和⑤这两个步骤,直到获得比较理想的结果。
(2)从头设计一个蛋白质的基本步骤:
①首先,将各项物理标准和统计数据组合在一起,结合研究人员的工作经验,借助计算机辅助的图像显示仪选定一个能与水溶性球蛋白相匹配的氨基酸顺序。
②在勾勒出目标蛋白的大体轮廓后,紧接着是对设计蓝图进行具体操作。
依据氨基酸残基的统计学数据的排列的优先顺序,先确定每个残基位置上的氨基酸。
③初步确定氨基酸顺序之后,再用MonteCarlo法或分子动力学进行能量极小化计算,使构象的能量水平达到最低和稳定,优化目标蛋白的三维模型。
然后,用各种已获得试验数据来检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理,对所设计的模型做进一步修正。
④对用多肽合成法或基因表达法获得的全新目标蛋白质,应采用光谱学的方法对其结构进行考查。
如果原来设计的目标蛋白质具有特殊生物功能,那么还要采用相应的生物化学方法测定其生物活力。
最后,还需要用X射线结晶学法准确测定目标蛋白质的三维结构,通常需要经过几轮或许多轮的设计、检验和再设计,方可获得一个正确折叠和带有人们渴望功能的目标蛋白质。
第5章食品酶工程
(细胞固定化技术:
是将完整的细胞连在固相载体上,免去破碎细胞提取酶的程序,保持了酶的完整性和活性的稳定。
1.简述食品酶工程的概念、有哪些基本原理及内容。
(1)概念:
酶工程,又称酶技术,就是利用酶催化作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化成所需要的产品的过程,它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。
酶催化原理、化工原理。
(3)内容:
可将酶工程分为化学酶工程(亦称初级酶工程,是指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。
它主要是酶学原理与化工技术相互渗透和结合而形成的一门科学技术)和生物酶工程(是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物,亦称高级酶工程)。
酶技术的应用。
3.酶反应器的种类有哪些?
固定化酶反应器的原理是什么?
酶反应器是利用游离酶或固定化酶将底物转化成产物的装置。
根据使用对象的不同,可分为游离酶反应器和固定化酶反应器。
(1)固定化酶反应器的类型:
间歇式搅拌罐(又称为间歇式酶反应器)、连续式搅拌罐(又称为连续搅拌釜式反应器)、固定床反应器(又称为填充床反应器)、流化床反应器、膜型反应器、第二代酶反应器。
(2)固定化酶反应器的设计原理。
酶反应器设计的主要目标是:
使产品的质量和产量最高,使生产成本最低。
酶反应器设计的主要内容,包括:
提高酶的比活和浓度,更好的酶反应过程调控,更好的无菌条件,以及克服速度限制因素。
(3)表示酶反应器性能的有下列参数:
生产力、产品转化率、酶的催化率、产物浓度和底物停留时间。
第6章发酵工程
(发酵:
狭义:
发酵是微生物在无氧条件下,通过分解代谢,降解有机物,同时积累简单的无机物并产生能量的生物氧化过程。
广义:
发酵泛指微生物在无氧或有氧条件下,通过分解代谢或合成代谢或次生代谢等微生物代谢活动,大量积累人类所需的微生物体或微生物酶或微生物代谢产物的过程。
2.何为生物反应器?
包括哪些类型?
发酵生产中怎样对发酵罐中的pH和通气条件进行控制?
发酵罐又称生物反应器。
任何提供生物活性环境的制造或工程设备,是人们对生物有机体进行有效控制的培养以生产某种产品或某种特定反应的容器
(2)类型:
根据菌种生理特性,有好氧发酵设备和厌氧发酵设备;
根据发酵培养基性质,有固体发酵设备和液体发酵设备;
根据发酵培养基厚度,有浅层发酵设备和深层发酵设备;
根据工艺操作,有分批式发酵设备和连续式发酵设备。
其中,好氧液体深层发酵设备在发酵工业中应用最多、最广泛。
在好氧液体深层发酵设备中,又有机械搅拌通风发酵设备(包括循环式的伍式发酵罐和文氏管发酵罐、非循环式的通风发酵罐和自吸式发酵罐)和非机械搅拌通风发酵设备(包括循环式的气提式发酵罐和液体式发酵罐、非循环式的排管式发酵罐和喷射式发酵罐)。
最新型的超滤式发酵罐。
好氧液体深层发酵设备:
机械搅拌通风密闭式发酵罐(机械搅拌通用式发酵罐)、改良的机械搅拌通用式发酵罐、机械搅拌自吸式发酵罐、机械搅拌伍式发酵罐、气升发酵罐、液提式发酵罐、膜生物反应器、基因工程菌生物反应器。
(3)pH调节和控制的方法主要有:
①调节培养基的原始pH,或加入缓冲物质,如磷酸盐、碳酸钙等,制成缓冲能力强、pH变化不大的培养基。
②选用不同代谢速度的碳源和氮源种类和比例。
③在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH的调节,进而合理地控制发酵过程。
④如果用弱酸或弱碱调节pH仍不能改善发酵状况时,通过及时补料的方法,既能调节培养液的pH,又可补充营养物质,增加培养液的浓度和减少阻遏作用,提高发酵产物的产率。
⑤采用生理酸性盐作为氮源时,由于NH4+被微生物细胞利用后,剩下的酸根会引起发酵液pH的下降;
向培养液中加入碳酸钙可以调节pH。
但需要注意的是,由于碳酸钙的加入量一般都很大,容易染菌。
⑥在发酵过程中,根据pH的变化,流加液氨或氨水,既可调节pH,又可作为氮源。
⑦流加尿素作为氮源,同时调节pH。
控制pH的应急措施还有:
①改变搅拌转速或通风量,以改变溶解氧浓度,控制有机酸的积累量及其代谢速度。
②改变温度,以控制微生物代谢速度。
③改变罐压及通风量,改变溶解二氧化碳浓度。
④改变加入的消泡油用量或加糖量等,调节有机酸的积累量。
(4)通气条件的控制:
(提高kLα的方法:
①提高搅拌速率。
②适当增加通风量,同时提高搅拌效率。
③适当提高罐压并采用富集氧的方法。
④在可能的情况下,尽量降低发酵液的浓度和黏度。
⑤采用机械消泡或化学消泡剂,及时消除发酵过程中产生的泡沫。
⑥采用径高比较小的发酵罐或大型发酵罐进行发酵。
5.什么是氧传递系数,影响氧传递系数的因素有哪些?
如何利用工艺措施提高培养液的溶解氧含量?
(1)N=kLα(C*-CL)。
N为氧的传递速率(mmol/h);
C*为溶液中饱和溶解氧浓度(mmol/L);
CL为溶液主流中的溶解氧浓度(mmol/L);
kL为以浓度差为推动力的氧传质系数(1/h);
α为比表面积,单位体积溶液所含有的气液接触面积(m2/m3)。
kLα称为液相体积氧传递系数,又称溶(解)氧系数(1/h)。
氧传递推动力为(C*-CL)。
(2)影响发酵设备的kLα的主要因素有:
搅拌效率、空气流速、发酵液的物理化学性质、泡沫状态、空气分布器形状和发酵罐的结构等。
(3)欲增加(C*-CL),就必须设法提高C*或降低CL。
①提高C*的方法:
影响C*的因素有:
温度、溶液的组成、氧的分压等。
由于发酵培养基的组成和培养温度不可任意改动,在分批发酵的中后期,通过补入部分灭菌水,降低发酵液的表观黏度,以此改善通气效果。
直接提高发酵罐压力或向发酵液通入纯氧气来提高氧分压的方法有很大的局限性;
而采用富集氧的方法,如将空气通过装有吸附氮的介质的装置,减少空气中的氮分压,经过这种富集氧的空气用于发酵,提高氧分压,是值得深入研究的有效方法。
②降低发酵液中CL的方法:
影响发酵液中CL的主要因素有:
通气量和搅拌速率等。
通过减小通气量或降低搅拌速率,可以降低发酵液中的CL,但发酵液中的CL不能低于C临界,否则,将影响微生物的呼吸作用。
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