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资料整理6ba的基本情况
1.豆芽质量安全的关键影响因素分析及对策:
1.1目前情况:
本文做了大量的实验,进行数据分析,讨论得出了研究结果,一是运用气相色谱-质谱技术开展了豆芽中农药残留的检测分析工作,结果表明豆芽中马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷、久效磷、甲胺磷、氧化乐果等农残合格率100%。
二是运用液相色谱-质谱联用技术开展了豆芽中的添加剂指标的检测分析工作,该方法采用有机溶剂盐析提取目标物和质谱负模式检测技术,有效提取目标物,去除杂质干扰,适合于市场样品实际检测,经检测6-苄基腺嘌呤与4-氯苯氧乙酸钠合格率分别为96.4%和76.7%。
三是运用原子荧光和微波消解前处理技术开展了豆芽中总砷的检测分析工作,经对市场35个豆芽样品的实际检测,结果表明合格率为100%,未检出总砷超标的豆芽样品。
四是运用紫外可见分光光度法检测分析了豆芽中亚硝酸盐和亚硫酸盐的含量情况,其中亚硝酸盐合格率89.7%、亚硫酸盐合格率为53.2%,这两项指标是影响上市豆芽质量的主要因素,同时,从不同单位豆芽产品的检测结果来看,小作坊生产企业豆芽合格率整体较低,安全隐患较大,而品牌豆芽的质量相对较好。
综合分析各实验数据,本文找出了影响豆芽质量安全的主要指标,为生产质量管理、市场执法监督、群众放心消费提供了数据支持。
1.2生产引入的污染物及危害
1.2.1生长调节剂的概述
(主要作用、限制用量、物理性质、化学性质、作用机理、毒理范围)
6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠俗称AB粉,是豆芽生产使用的2个主要添加剂,主要作用是促进豆芽生长、抑制长根,提高产量。
国家标准GB2760《食品添加剂使用卫生标准》规定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留量小于1.0mg/kg、6苄基腺嘌呤残留量小于0.2mg/kg。
6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurne)分子式C12H11N5,相对分子质量225.25。
白色微针状结晶或类白色粉末,难溶于水,可溶于酸、碱,在酸性、碱性条件下均稳定。
6-苄基腺嘌呤是一种人工合成的细胞分裂素,与植物内源激素具有相似的结构和性质,能够抑制植物叶内叶绿素、核酸和蛋白质分解,广泛用作于无根豆芽的生长调节剂。
人体摄入过多6-BA会刺激皮肤黏膜,造成食道、胃黏膜损伤,出现恶心,呕吐等现象。
6-苄基腺嘌呤毒性LD50大鼠口服2965mg/kg(bw)(雄性);大鼠口服1005.19mg/kg(bw)(雌性);蓄积毒性试验雌性大鼠蓄积系数大于5,雄性大鼠蓄积系数为3,均属弱蓄积性;致突变试验:
Ames试验骨髓微核试验、小鼠睾丸染色体畸变试验、均未见有致突作用。
1.3豆芽质量卫生评价标准
1.3.1国标
1.3.2地方标准—北京
北京市以奥运食品保障工程为契机,加强政府引导和投入,大力发展现代化豆芽企业,并研究制定了豆芽系列地方标准。
《豆芽安全卫生要求》DB11/377—2006,规定了影响豆芽质量卫生安全项目,并提出具体指标(见表1-2)。
表1-2北京市豆芽地方标准主要有害物质限量指标
《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美双的测定》DB11/T379—2006(见另一文件)
1.4豆芽行业发展现状
1.4.1国外豆芽行业发展现状
豆芽菜的生产技术早年由中国传入日本及新加坡、泰国等东南亚国家,此后辗转传到西欧和美洲大陆。
在国外,日本是豆芽生产和消费的主要国家,豆芽菜深受当地人民所喜爱,同时,其豆芽生产技术也处于同行业国际先进水平。
20世纪50年代,日本等国率先采用现代技术,相继推出了能自动控温和淋水的“豆芽机”,并使用了无根豆芽专用剂,推出了“无根豆芽”产品,使传统的豆芽菜栽培技术及其产品有了新的发展。
1.4.2国内工厂化豆芽企业发展现状
北京东升方圆农业种植开发有限公司,2005年,该公司投资引进国内外先进都压生产设备及生产技术,建成6000平方米高智能育苗准化生产车间,绿豆芽、黄豆芽等品种日生产能力已达60吨。
宁波五龙潭蔬菜食品有限公司生产的“新潮”牌豆芽于2002年8月上市。
引进先进的全自动生产流水线和清洗包装线及工艺,工厂化孵化豆芽,此举填补了当时国内同行业现代化发展空白,为广大消费者提供了放心、安全、绿色农产品。
2006年8月8日,上海原野蔬菜食品有限公司生产的“菜博士”牌豆芽正式上市销售。
该公司在东北建有2000余亩无农药残留和无污染的黄豆、绿豆原料生产基地,采用日本大生食品公司的先进技术设备,工厂设计符合国际HACCP的认证规范。
绿豆经过原料筛选(浸泡、消毒、清洗)、孵化(无菌的孵化车间催芽)、自动清洗(去壳、脱水)包装、冷库内保鲜等先进的生产加工工艺,并实行完全智能化的专业操作管理。
1.5豆芽添加剂残留的分析与评价(6BA)
1.5.16-苄基腺嘌呤残留的分析与评价
目前,豆芽样品中6-苄基腺嘌呤残留检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法[52~55]等,前处理技术多为酸化甲醇提取目标物供液相色谱或质谱分析。
本文运用乙腈提取、盐析分离技术提取目标物,运用液相色谱-质谱连用技术进行检测。
1.5.2实验部分
样品处理:
称取5.0(精确至0.01g)捣碎的豆芽样品于50ml离心管中,加入10ml乙腈,用搅拌器充分振荡3min,加入无水硫酸镁6g,再次震荡3min,以5000r/min离心5min,取上清液,过0.2μmPVDF滤膜,供检测分析。
1.5.3试验结果与讨论
1.提取与净化:
质谱采用负离子模式能有效去除干扰,样品处理重点在于减少步骤、提高目标物提取率。
根据6-苄基腺嘌呤难溶于水可溶于酸、碱的化学特性,实验确定在中性条件下,样品以有机溶剂浸泡后盐析分层提取目标物检测的基本思路。
豆芽样品中加入蒸馏水、磷酸盐缓冲液(pH7.0)、不添加任何基质三种条件,经有机溶剂提取后进行质谱检测,经试验三种条件对目标物提取的影响没有显著差异,为简化操作,确定以实际样品直接加有机溶剂提取。
提取溶剂和盐的选择上,分别采用丙酮、乙腈与硫酸镁、氯化钠交叉试验,--采用乙腈/硫酸镁盐析方法提取目标物回收率高、稳定且杂质干扰少,利于色谱分离。
实际样品在0.1mg/kg添加浓度下以乙腈/硫酸镁盐析方法平行测定7次,平均添加回收率为92.2%、相对标准偏差7.4%。
2.色谱条件优化:
考虑6-苄基腺嘌呤色谱分离和质谱对流动相的要求以及电离条件等诸因素,实验分别以0.01mol/L乙酸铵、0.1%乙酸作为流动相改性剂,以二极管阵列检测器267nm波长和质谱负模式同时检测。
结果表明,甲醇为流动相,当以0.1%乙酸作为改性剂时,色谱分离、质谱信号响应均较好;当以0.01mol/L乙酸铵作为改性剂时,6-苄基腺嘌呤色谱分离差,考虑质谱对盐的不耐受因素,最终确定以甲醇+0.1%乙酸水溶液(体积比为75:
25)为流动相。
3.质谱条件优化:
6-苄基腺嘌呤分子结构式为
,其化学特性使其可以经电离生成[M+H]+和[M-H]-两种离子,经试验表明,目标物在正负模式下均由较好的信号响应。
4.工作曲线的制作:
5.回收率、精密度:
将不含6-苄基腺嘌呤残留的黄豆芽样品捣碎混匀后,按每份5.0g取样量,分别添加0.1μg、0.25μg、0.5μg共3个不同量的6-BA标准,按照1.2方法做添加回收实验,结果样品添加回收率在89.0%~92.2%之间,相对标准偏差≤9.9%。
表2-5精密度及回收率试验结果(n=7)
6.检出限:
根据NATA(NationalAssociationofTestingAuthoritiesAustralia)
给出的化学测试方法进行测试,检出限(LOD)试验方法为:
进行3个浓度水平的添加回收试验,每个浓度水平7个平行试验。
以7个平行试验的标准偏差对浓度作图,曲线在y轴上的截距为S。
,LOD=3×S。
(置信水平95%)。
根据0.02、0.05、0.1mg/kg3个浓度水平,每个浓度水平7个平行样的测定结果(见表1),计算S。
=0.0007,由此得出方法检出限(LOD=3×S0)为0.0021mg/kg(置信水平95%)。
1.5.4实验结果
按照青岛市地方标准限量要求小于0.2mg/kg判断,结果1批次不合格,平均合格率96.4%,结果见下表2-6。
表2-6市场豆芽6-苄基腺嘌呤残留检测结果一览表
1.6结论--生长调节剂的使用管理有待规范
通过对豆芽6-苄基腺嘌呤和4—氯苯氧乙酸钠残留检测,结果表明4—氯苯氧乙酸钠合格率为76.7%、6-苄基腺嘌呤合格率为96.4%。
这说明这两种添加剂是豆芽生产必需的两种中药添加剂,可作为市场豆芽质量监控的重要指标。
只有加强生产过程的质量管理,规范使用量,才能保证上市豆芽质量。
2.六苄基腺嘌呤质量检测方法的研究及其在蔬菜中残留量的确定
2.1绪论
2.1.1作用:
六苄基腺嘌呤(N6-Benzylaminopurine,6-BA)是一种人工合成的植物生长激素,主要作为促长剂和保鲜剂使用。
能够促进与调节植物生长发育以及蔬菜、水果的保鲜和储存。
六苄基腺嘌呤是第一个人工合成的细胞分裂素,主要成份是嘌呤类生物碱和一些无机物,在细胞分裂素中具有较高活性。
六苄基腺嘌呤作为植物促长剂和果蔬保鲜剂的主要成分,已在国内外进入应用阶段。
目前,六苄基腺嘌呤的应用已经拓展到农业、果树栽培和园艺等领域[1-4]。
作为植物促长剂使用,6-BA能提高种子发芽率,促进幼苗生长,最终提高产率,常被用于促进豆芽的生长,提高烟叶的产量等。
在作物生长过程中,6-BA能够起到将氨基酸生长素、无机盐等向植物的茎、根等部位输运的作用,改善其生长。
另外6-BA还能够通过抑制植物内的叶绿素、核酸、蛋白质分解、抑制呼吸等方式对作物防衰保鲜,因此6-BA适用于各种绿叶蔬菜(如青椒、黄瓜、豆角等)贮藏前使用
2.1.2使用量及毒理作用
六苄基腺嘌呤已被广泛应用于农业、果树栽培和园艺等领域。
六苄基腺嘌呤在豆科植物促长,蔬菜的防腐储存等方面普遍使用,因此六苄基腺嘌呤在市售水果和蔬菜中一般都有一定的残留,文献报道人体摄入过多会刺激食道、胃黏膜,造成食道、胃黏膜损伤,出现恶心、呕吐等现象[11]。
国家标准GB2760-1996将六苄基腺嘌呤(6-BA)作为允许使用的食品添加剂,同时也规定了六苄基腺嘌呤(6-BA)的最高允许使用限量(0.01g/kg)和最高允许残留量(0.20mg/kg)。
2.1.3实验前处理及其检测范围
本文以酸化甲醇为提取剂,用超声和微波两种提取方法提取蔬菜中六苄基腺嘌呤(6-BA)残留量,优化了提取温度、提取时间和液固比等微波提取条件,并以甲醇/水/乙腈(v/v,55/40/5)为流动相,采用高效液相色谱法对蔬菜中六苄基腺嘌呤残留量进行检测。
微波提取与超声提取方法相比提取产率高、提取时间短,更适用于蔬菜中六苄基腺嘌呤的提取。
高效液相色谱法检测蔬菜中六苄基腺嘌呤残留量方法的线性范围为0.050-80µg/mL,检出限为0.016mg/kg,加标回收率为92.82-96.98%,RSD小于3.8%。
方法已用于绿豆芽、黄豆芽、黑豆芽、豆苗、菜花和西兰花等实际样品中6-BA残留量的检测。
研究方法准确、简便,适用于果蔬中六苄基腺嘌呤残留量的检测。
2.2高效液相色谱法测试六苄基腺嘌呤的含量:
2.2.1高效液相色谱简介:
高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在经典液相色谱理论的基础上,在60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的,它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography,HPLC),又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography,HSLP),也称高效液相色谱[28]。
HPLC有以下特点高压—压力可达150~300Kg/cm2;高速—流速为0.1~10mL/min;高效—可对百余种物质同时进行分离测试;高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng;样品消耗量少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:
检测速度快—通常分析一个样品只需15~30min,有些样品甚至在5min内即可完成;分辨率高—可对例如手性物质等差异性很小的物质进行分离分析;灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg;柱子可反复使用,一根色谱柱可分离不同的化合物;样品用量少;易回收;样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做样品制备。
2.2.2高效液相色谱法的基本原理与分类
高效液相色谱技术选用液体为流动相,溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过分离系统时,由于与分离系统中的固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而从固定相中先后流出,完成分离,将从多组分混合物中分离出来的单一组分进行定性检出和定量检测的分析方法称为高效液相色谱法。
高效液相色谱法中包括多种分离模式,按色谱过程的分离机制,可将液相色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱、亲和色谱和化学键合相色谱。
根据流动相与固定相极性的差别,也可分为正相色谱和反相色谱两种模式。
流动相极性大于固定相极性时,称为反相色谱(RP);反之,称为正相色谱(NP)[28]
高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的设备,其基本单元如图3.5所示。
高效液相色谱仪至少应包括高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和微机控制与数据处理系统构成。
图3.5高效液相色谱仪示意图
2.3实验
2.3.1标准溶液的配制
准确称取50mg标准品(精确至0.00001g),置于小烧杯中用少量50%甲醇溶液溶解,滴加少量0.1mol·L-1HCl溶液助溶,转移至50mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容。
此溶液浓度为1.00mg·mL-1的6-BA标准储备液。
准确移取6-BA标准储备液10.00mL于100mL容量瓶中,用50%甲醇溶液稀至刻度,此6-BA溶液的浓度为100.00µg·m-1。
2.3.2样品(食品级)溶液制备
准确称取6-BA样品0.03g(精确至0.00001g),置于小烧杯中用50%甲醇溶液溶解,加入少量0.1mol·L-1HCl溶液助溶,转移至250mL容量瓶中,用50%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀。
适量移取上述样品储备液于25mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容。
备用。
2.3.3实验方法
1-标准曲线绘制:
分别移取浓度为100.00µg·mL-1的6-BA标准储备液0.05、0.10、0.25、0.75、1.25、1.50、2.50mL于25mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容。
配制成浓度分别为0.20、0.40、1.00、3.00、5.00、6.00、10.00µg·mL-1的6-BA标准系列。
上述溶液经0.45μm滤膜过滤后,按已选定的色谱条件直接测试,记录峰面积,以浓度c(µg·mL-1)对峰面积y进行线性回归,得到线性回归方程。
2-样品测试:
适量移取2.3.2中样品储备液于25mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容。
样品溶液经0.45µm滤膜过滤后,按已选定的色谱条件直接测试,记录峰面积A,带入回归线方程求得实际含量。
2.4结果讨论
2.4.1六苄基腺嘌呤HPLC色谱图
实验中选定流动相为甲醇/水:
60/40,流速为1.0mL/min,柱温为30℃,进样量为20µL,检测器选用紫外检测器,检测器波长仍选定270nm。
图3.66-BA标准品与样品色谱图
2.4.2甲醇浓度的选择
食品级六苄基腺嘌呤是一种纯品,图3.6可以看出基本无杂质干扰,因此流动相的选择可以只考虑保留时间这一因素,保留时间与甲醇/水有关。
实验分别考察了甲醇/水(50/50),甲醇/水(55/45),甲醇/水(60/40),甲醇/水(65/35),甲醇/水(70/30)等不同流动相配比对样品保留时间的影响,依据实验结果,本文选择了以60%甲醇为流动相进行测试。
(见图3.7)。
图3.7甲醇浓度对保留时间的影响
2.4.3流速的选择
在高效液相色谱分析中,流速范围通常在0-2mL/min。
本实验中,选择保持流动相配比为甲醇/水(60/40),柱温为30℃,通过改变流速进行测试,结果如图所示(见图3.8)。
图3.8流速对保留时间的影响
实验中分别在4个流速下测试试样的保留时间,保留时间均随着流速的增大而减小,此时色谱峰逐渐变宽。
流速增大,保留时间减小,色谱峰峰型好,但是同时色谱柱的压力也会增大,过高的压力会对色谱柱产生损害,从而缩短色谱柱的使用寿命,甚至降低柱效,影响分析结果的准确度。
综上所述实验中选择流速为1.0mL/min。
2.4.4柱温的选择
在HPLC分析中,柱温也是一个很重要的参数,通常在柱压允许的情况下,以达到最佳分离状态(即最佳柱压)为目的的选择柱温。
实验中选择流速为1.0mL/min、流动相为甲醇/水(60/40),改变柱温对试样进行测试,柱温与保留时间的曲线关系(图3.9)。
图3.9柱温对保留时间的影响
实验中分别在5个柱温下测试试样的保留时间,保留时间均随着柱温的升高而减小,本文选择柱温为30℃。
2.4.5标准曲线
配制6-BA溶液浓度分别为0.40、1.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00µg/mL的标准工作液,用0.45µm滤膜过滤后,直接注入色谱仪测试,记录峰面积,以浓度c(mg/L)对峰面积y进行线性回归,得6-BA回归方程为y=81.784x+2.15(R2=0.9998)。
图3.106-BA的标准曲线
2.4.6检出限
在选定的最佳色谱条件下(甲醇/水:
60/40,流速:
1.0mL/min,柱温:
30℃,样量20µL)对浓度为0.04µg·mL-1的6-BA标准溶液进行9次平行实验,记录峰面积,计算方法的检出限和测定限。
以样品信号值标准偏差的三倍与灵敏度的比值,计算方法的检出限。
以样品信号值标准偏差的十倍与灵敏度的比值,计算方法的测定限。
表3.3方法检出限与测定限
2.4.7实验结果
采用上述方法对食品级6-BA样品进行了10次实验,其平均含量为98.49%,标准偏差为0.20,相对标准偏差为0.20%。
结果列于表3.4。
表3.4高效液相色谱法6-BA样品分析结果(ω质量分数/102)
3.高效液相色谱-串联质谱测定豆芽中6-苄氨基嘌呤方法的研究
3.1前言
6-苄氨基嘌呤是一种广谱植物生长调节剂,可显著促进柑桔保花保果及幼果生长,打破再生芽休眠等[1],但从食品安全的角度来看,植物生长促进剂和其他农药一样,也有一定的毒性[2]。
目前6-苄氨基嘌呤的检测方法主要有紫外分光光度法[5]和高效液相色谱[6-7],但豆芽中6-苄氨基嘌呤高效液相色谱-串联质谱测定方法报道较少。
本实验采用HPLC-MS/MS技术,该技术具有检测限低,灵敏度高、准确可靠等优点,该法简便易行,准确可靠,可降低检测成本,节省分析时间,适于生产质量控制。
3.2结果与讨论
3.2.1高效液相色谱条件的优化
色谱柱:
MGⅡC18柱5μm2.0mm×150mm高效液相色谱柱
流动相:
,水(含0.1%甲酸)-甲醇(0.1%甲酸)做为流动相并采用梯度洗脱时,分析目标物的分离度和灵敏度较高。
3.2.2质谱定量定性
根据6-苄氨基嘌呤分子结构的特征,实验选用电喷雾正离子(ESI+)电离模式对0.1mg/L标准液进行Q1全扫描;并确定6-苄氨基嘌呤电离出的母离子,继续对其进行Q3全扫描,找出2个信号较强的碎片离子与母离子组成监测离子对:
m/z226/91.0(定量)、226/147.9。
3.2.3前处理条件优化
6-苄氨基嘌呤难溶于水,在甲醇和乙腈的溶解度较高,在酸、碱性条件下比较稳定。
因质谱扫描方式选择了正离子扫描模式,所以考察了酸化乙腈、酸化甲醇、酸化甲醇水溶液、酸化乙腈水溶液四种不同提取溶液的提取效率进行了实验
实验结果表明提取率:
酸化甲醇(甲醇的毒性比乙腈小,流动相也是甲醇)≈酸化乙腈>酸化甲醇水溶液>酸化乙腈水溶液态度。
3.2.4分析方法线性相关性及方法的检出限
在优化的液相色谱及质谱条件下,对一定范围浓度的标准溶液,在选定的条件下时测定,用质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制工作曲线。
图26-苄氨基嘌呤工作曲线图
呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.9996,线性方程:
y=22477.7561x-1750.5236。
样品经前处理后进行分析,得到方法检出限(信噪比S/N=3)为2.2μg/kg、方法的定量检出限7.3μg/kg(信噪比S/N=10)。
3.2.5回收率、精密度实验及实际样品检测
采用上述的实验方法在豆芽样品添加6-苄氨基嘌呤标液做加标回收和精密度实验,分别添加了3个不同浓度水平的混合标准溶液,每个添加水平重复测定6次,计算回收率及精密度(以相对标准偏差表示),3个质量浓度的加标水平分别为:
0.2、1.0、2.0μg/L,平均加标回收率和精密度结果见表3。
3.2.6实际样品的测定
图3a阳性样品色谱图,b样品加标色谱图
4.高效液相色谱法在食品分析中的应用
4.1高效液相色谱仪
4.1.1主要部件:
贮液罐、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。
4.1.2基本的工作流程
贮液罐中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来
储液罐:
位置要高于泵体,以便保持一定的输液静压差。
密闭,以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化,还可防止空气中氧气和二氧化碳重新溶解于已脱气的流动相中。
高压输液泵:
恒压泵和恒流泵
1.耐化学腐蚀:
普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢。
2.在高压下连续工作:
耐压40MPa/cm~50MPa/cm能在8h~24h连续工作。
3.输出流量范围宽。
4.输出流量稳定,重复性高。
色谱柱
检测器:
灵敏度高、重复性好、线性范围宽、适应范围广、对流量和温度的变化不敏感等特性。
常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器(RID)、电导
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