云杉巴山冷杉枝叶中黄酮类物质提取研究.docx
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云杉巴山冷杉枝叶中黄酮类物质提取研究
目录
一前言5
二材料与方法5
1.实验材料5
1.1主要试剂5
1.2仪器设备5
2.方法5
2.1样品采集与处理5
2.2芦丁标准液的配制6
2.3标准曲线的绘制6
2.4定性验证试验6
2.4.1材料粗处理6
2.4.2定性分析6
2.5待测样品液的制备6
2.6待测样品液的测定7
3.结果与分析7
3.1定性验证试验7
3.2提取工艺优化8
3.2.1单因素试验设计8
3.2.1.1液料比选择8
3.2.1.2提取时间的确定8
3.2.1.3提取温度的确定9
3.2.1.4溶剂的确定10
3.2.2响应面法试验设计10
3.2.3云杉、巴山冷杉响应面法优化设计与结果11
3.2.3回归方程的方差分析14
3.2.3优化实验工艺参数的实际试验验证25
三实验结论与分析25
1.实验结论25
2.实验存在的问题与不足25
参考文献26
附录27
致谢60
云杉、巴山冷杉枝叶中黄酮类物质提取研究
学生:
刘海洋指导老师:
樊金拴
摘要:
采用薄层层析、颜色反应初步分析了巴山冷杉提取物和云杉提取物中含有的黄酮类物质。
通过单因素实验确定了对于云杉、巴山冷杉针叶中黄酮类物质的提取中提取时间、液料比、提取温度和乙醇体积分数这四个影响因素。
而后通过响应面分析试验方法,研究了提取时间、液料比、提取温度和乙醇体积分数这四个因素对云杉、巴山冷杉针叶中黄酮类物质的提取的具体影响。
结果表明,所选取的因素中,提取时间对巴山冷杉针叶中黄酮类物质提取率的影响最大,其次是提取温度以及乙醇体积分数,而液料比对其影响最小。
在众多的组合试验中,结合实际试验情况,理论上以提取时间为4.01h、液料比为24.8ml/g、提取温度为74.6℃、乙醇体积分数为71%时提取效果最佳,其黄酮的吸光度值为0.2222,实际实验验证吸光度值为0.231,与理论值相对偏差为3.96%;所选取的因素中,提取时间对云杉针叶中黄酮类物质提取率的影响最大,乙醇体积分数、液料比、提取温度因素并列次之,在众多的组合试验中,结合实际试验情况,理论上以提取时间为4.05h、液料比为25.4ml/g、提取温度为75.3℃、乙醇体积分数为69%时提取效果最佳,其黄酮的吸光度值为0.1564,实际实验验证吸光度值为0.143,与理论值相对偏差为8.57%。
关键词:
巴山冷杉;云杉;黄酮;提取;响应面法
TheextractionresearchofflavonoidsintheAbiesfargesiiandPiceaasperataconiferous
Student:
LiuHaiyangInstructor:
FanJinshuan
Abstract:
Thinlayerchromatography,apreliminaryanalysisofthecolorreactionofextractsthatPiceaasperataandAbiesfargesiiextractcontainsflavonoids.DeterminedbysinglefactorexperimentsforPiceaasperataandAbiesfargesiineedleextractionofflavonoidsintheextractiontime,liquidratio,extractiontemperatureandethanolconcentrationofthesefourfactors.Thentestmethodbyresponsesurfaceanalysistostudytheextractiontime,liquidratio,extractiontemperatureandethanolconcentrationofthesefourfactorsonthespruce,Abiesfargesiineedleextractionofflavonoidsinthespecificimpact.Theresultsshowedthattheselectedfactors,theextractiontimeonconiferAbiesfargesiiflavonoidsextractionrate,followedbytheextractiontemperatureandethanolconcentration,whiletheliquidratiotoitslowest.Amongthemanycombinationsoftests,withtheactualtestsituation,intheory,toextractthetimeof4.01h,liquidratiowas24.8ml/g,extractiontemperatureis74.6℃,71%ethanolextractthebesttime,theflavonoidsabsorbancevalueof0.2222,theactualexperimentstheabsorbancevalueof0.231,withthetheoreticalvalueoftherelativedeviationof3.96%;Theselectedfactors,theextractiontimeonthePiceaasperataneedlesFlavonoidsrateofthelargestethanol,liquidratio,extractiontemperaturefactorstiedforsecond,andinmanycombinationsoftests,withtheactualtestsituation,Theorytoextractthetimeof4.05h,liquidratiowas25.4ml/g,extractiontemperatureis75.3℃,69%ethanoltoextractthebesttime,theabsorbancevalueof0.1564ofitsflavonoids,theactualexperimenttheabsorbancevalueof0.143,therelativedeviationwiththetheoreticalvalueof8.57%.
Keywords:
Abiesfargesii;Piceaasperata;Flavonoids;Extraction;responsesurfacemethod
一前言
黄酮类化合物(flavonoids)又称黄酮体、黄碱素和类黄酮,基本结构单元是2-苯基苯并[α]吡喃或黄烷核,包括两个苯环(A和B)通过杂环-吡喃环相连(C)。
根据中央三碳链的氧化程度,B-环琏接位置以及三碳链是否构成环状等特点,主要的黄酮类化合物可分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类、花色素、黄烷-3,4二醇类、双苯毗酮类、黄烷-3-醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、酮类、查耳酮类、橙酮类及高异黄酮类等[1]。
黄酮类化合物广泛分布于植物体中,其资源丰富,是一类天然的具有生物活性的物质[2,21]。
其对人体功效作用包括:
1、抗氧化作用,2、增强免疫调节作用,3、抗衰老和抗疲劳作用,4、降血脂作用,5、抗菌作用,6、诱导肿瘤细胞凋亡的作用等。
黄酮类物质的开发、综合利用已成为当今的热门话题。
现已开发出来的产品包括黄酮软饮料、黄酮啤酒、黄酮保健胶囊、黄酮抗氧化剂、黄酮美容护肤品等[1,3,4]。
巴山冷杉(Abiesfargesii)和云杉(Piceaasperata)均为我国的特有树种。
广泛分布于陕西南部、甘肃南部及东南部,是西北地区较为常见的两种高大乔木,是组成西部针叶林的重要树种[5]。
但以往的研究多集中于林学及生态方面,未见对这两种植物的黄酮类物质的提取研究报道,故本文对两种植物针叶中黄酮类物质的提取工艺和含量进行研究,旨在为巴山冷杉和云杉的高效经济利用提供一些参考依据。
二材料与方法
1.实验材料
实验中所用的巴山冷杉采自甘肃省康乐县莲花山,云杉采自甘肃省临洮县岳麓山。
1.1主要试剂
无水乙醇(AR)、硝酸铝(AR)、氢氧化钠(AR)、亚硝酸钠(AR)、芦丁标准对照品(中国药品生物制品检定所)、三氯甲烷(AR)、甲醇(AR)、三氯化铁(AR)、硫酸(AR)、盐酸(AR)、镁粉、浓氨水、三氯化铝(AR)、石油醚(30~60℃馏分)
1.2仪器设备
电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器公司);UV-3型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器公司);AUY220型岛津SHIMADZU电子分析天平、R206型申科旋转蒸发器(上海申生科技公司)、鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)、ZF-1型三用紫外分析仪(上海金鹏分析仪器公司)。
2.方法
2.1样品采集与处理
将采集的两种植物的新鲜针叶经去杂处理后以清水漂洗除去其表面附着的灰尘并及时沥干水分,于(40±1)℃鼓风干燥48h,自然冷却后再用植物原料粉碎机进行粉碎、过筛,贮于大锥形瓶中备用。
2.2芦丁标准液的配制
准确称取10mg已烘干至恒重的芦丁标准品,以60%乙醇溶液定容至50ml作为标准储备液。
2.3标准曲线的绘制
准确移取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml芦丁标准储备液于6个10ml棕色容量瓶中,再分别加入0.3ml5%亚硝酸钠水溶液,摇匀后静置6min,加入0.3ml10%硝酸铝水溶液,摇匀后静置6min,再分别加入4ml1M氢氧化钠水溶液,用30%乙醇定容至10ml,在80℃水浴中保温10min[6,7]。
以30%乙醇为空白,用1cm比色皿,在480nm-600nm波长范围内测得最大吸收波长为510nm,则在510nm处分别测定不同浓度芦丁标准样液的吸光度。
将芦丁含量和吸光度的对应关系用最小二乘法作线性回归,得标准曲线方程[8]:
Y=1.5021x-0.0064,R2=0.9985(式中:
x的单位为mg)。
吸光度对芦丁含量曲线呈良好的线性关系。
2.4定性验证试验
2.4.1材料粗处理
各称取(2±0.002)g巴山冷杉、云杉已粉碎试样分别放入两个索氏提取器的滤纸筒中,用60%乙醇进行提取、回流至虹吸液几乎无色时为止。
提取液经抽滤、蒸发浓缩、用石油醚萃取去脂和色素后,再用100ml30%乙醇溶解成稀释液备用[9,10]。
2.4.2定性分析
薄层层析分别取云杉和巴山冷杉提取稀释液和芦丁对照品溶液点于两块已活化的硅胶层析板上,以V氯仿:
V甲醇(8.5:
1.5)为展开剂在层析缸中进行展开,用1%三氯化铁水溶液进行喷雾显色,观察层析结果。
颜色反应取五支试管分别加入巴山冷杉提取稀释液2ml并将其中一支试管作空白对照,取五支试管分别加入云杉提取稀释液2ml并将其中一支试管作空白对照。
在已装有云杉、巴山冷杉提取液的4支试管分别加入:
①浓硫酸2-3滴;②少量镁粉及4-5滴浓盐酸;③2-3滴1%三氯化铁水溶液;④4-5滴1%氢氧化钠,观察反应后的颜色变化情况。
⑤取云杉、巴山冷杉的提取稀释液少量各涂于一张洁净的滤纸上,晾干后喷1%三氯化铝乙醇溶液,再吹干,观察现象;⑥取云杉、巴山冷杉的提取稀释液少量各涂于一张洁净的滤纸上,晾干后置于浓氨水上方熏30s左右,观察现象[2]。
2.5待测样品液的制备
各称取(2±0.002)g巴山冷杉、云杉已粉碎试样,分别放入两个圆底烧瓶中,加入一定体积的特定浓度的乙醇,接上冷凝管在适宜的温度下恒温回流提取一段时间。
用布氏漏斗趁热抽滤,取滤液经石油醚萃取去脂及色素后减压真空浓缩成浓缩液,再用30%乙醇配成100ml稀释液[18-20]。
2.6待测样品液的测定
用移液管分别移取1ml巴山冷杉、云杉提取稀释液于两个10ml棕色容量瓶中,分别加入0.3ml5%亚硝酸钠水溶液,摇匀后静置6min,加入0.3ml10%硝酸铝水溶液,摇匀后静置6min,再分别加入4ml1M氢氧化钠水溶液,用30%乙醇定容至10ml,在80℃水浴中保温10min[2]。
再在510nm处测样品提取液的吸光度。
3.结果与分析
3.1定性验证试验
薄层层析将巴山冷杉、云杉提取稀释液分别点于两块层析板上,再分别点样芦丁标准品液,经展开剂分离后喷上显色剂,得到3个谱带,其Rf值见下表。
Rf值
巴山冷杉样液
芦丁对照品
Rf值
云杉样液
芦丁对照品
样点一
0.347
样点一
0.429
样点二
0.707
0.387
样点二
0.786
0.457
样点三
0.96
样点三
0.971
其中,巴山冷杉中的样点一与芦丁标准对照品的Rf值接近,云杉中的样点一与芦丁标准对照品的Rf值接近,说明两种植物的这个样点的物质和芦丁的结构相近。
颜色反应在巴山冷杉、云杉的提取稀释液中加入不同化学显色剂,其呈色结果见下表:
巴山冷杉提取液定性显色反应
所加试剂
浓硫酸
盐酸+镁粉
1%FeCl3水溶液
1%NaOH水溶液
1%AlCl3乙醇液
浓氨水
现象
深黄色
橙红色
黑色
黄褐色
黄色
黄色
结论
有黄酮类化合物存在
云杉提取液定性显色反应
所加试剂
浓硫酸
盐酸+镁粉
1%FeCl3水溶液
1%NaOH水溶液
1%AlCl3乙醇液
浓氨水
现象
棕黄色
黄色
墨绿色
黄褐色
黄色
黄色
结论
有黄酮类化合物存在
3.2提取工艺优化
3.2.1单因素试验设计
各称取约2g原料,用乙醇体积分数占70%的溶剂,按照液料比20mL/g,在70℃下提取2h。
当研究其中某一因素时,其他条件保持不变,得到的提取液,按照标准曲线处理方法,在510nm处出测定吸光度,以黄酮吸光度为指标,比较不同提取条件下黄酮的提取效果。
3.2.1.1液料比选择
选取15ml/g、20ml/g、25ml/g、30ml/g、35ml/g的液料比提取黄酮,按照单因素试验设计方法研究最佳液料比。
图3.1液料比对黄酮提取效果的影响
由图3.1可看出,吸光度随料液比增加而升高,在液料比为25ml/g时达到峰值,此时吸光度云杉为0.069、巴山冷杉为0.046,当到达峰值后出现下降趋势。
3.2.1.2提取时间的确定
将植物原料分别选取1h、2h、3h、4h、5h,按照单因素试验设计方法研究最佳提取时间。
图3.2提取时间对黄酮提取效果的影响
由图3.2可看出,吸光度提取时间的延长而升高,在提取时间为4h时达到峰值,此时吸光度云杉为0.129、巴山冷杉为0.180,当到达峰值后呈现下降趋势。
另外,从图中看出,在交点之前云杉吸光度高于巴山冷杉,而交点之后巴山冷杉的吸光度高于云杉。
分析其原因可能是巴山冷杉枝叶的细胞结构过于紧密,从而不利于其中的黄酮分子随溶剂溶出,但可以肯定的是巴山冷杉的黄酮含量高于云杉。
3.2.1.3提取温度的确定
将植物原料分别置于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃温度下提取,按照单因素试验设计方法研究最佳提取温度。
图3.3提取温度对黄酮提取效果的影响
由图3.3可看出,吸光度随提取温度增加而升高,在提取温度为75℃时达到峰值,此时吸光度云杉为0.077、巴山冷杉为0.043,当到达峰值后出现下降趋势,其原因可能是温度过高从而造成其中的黄酮结构被破坏。
3.2.1.4溶剂的确定
根据原料的性质选择能够溶解黄酮且无毒安全、提取率高、价廉的溶剂。
分别选用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇以及水、乙酸乙酯作为溶剂进行提取,按照单因素试验设计方法研究最佳提取溶剂。
图3.4溶剂对黄酮提取效果的影响
由图3.4可知,溶剂对黄酮吸光度有很大影响,其中乙醇提取效果较水和乙酸乙酯好,而不同体积分数的乙醇水溶液中,以70%体积分数的乙醇水溶液的提取效果最好。
3.2.2响应面法试验设计
由单因素试验设计中可得出,液料比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数这四个因素都会不同程度地影响云杉、巴山冷杉中黄酮的提取效果,作为优化实验变量因素具有很高的可靠性。
为寻找适宜的提取黄酮的工艺条件,决定采用响应面法[11-14]。
在单因素试验的基础上,借助DesignExpert软件,采用中心组合试验设计(Box-BehnkenDesign,BBD)原理,选取提取时间、提取温度、乙醇体积分数、液料比为试验因素,以云杉、巴山冷杉吸光度值为试验指标,进行响应面分析试验。
实验因素水平见下表1。
表3.1响应面法试验因素水平
因素
水平
A
B
C
D
液料比ml/g
提取时间t/h
提取温度T/℃
乙醇体积分数%
1
20
3
70
60
2
25
4
75
70
3
30
5
80
80
3.2.3云杉、巴山冷杉响应面法优化设计与结果
借助DesignExpert软件分析,按照BBD中心组合试验方案进行4因素3水平试验,巴山冷杉试验结果见表3.2,云杉试验结果见表3.3。
表3.2巴山冷杉黄酮提取响应面试验设计及结果
试验号
A:
液料比
B:
提取时间
C:
提取温度
D:
乙醇体积分数
Y1吸光度值
ml/g
h
℃
%
1
30
3
75
70
0.154
2
25
4
70
60
0.133
3
30
5
75
70
0.147
4
25
5
70
70
0.155
5
25
4
75
70
0.226
6
25
5
75
80
0.162
7
20
4
75
60
0.139
8
20
4
80
70
0.166
9
25
3
80
70
0.159
10
30
4
75
80
0.171
11
25
4
70
80
0.161
12
30
4
70
70
0.193
13
30
4
80
70
0.17
14
25
4
75
70
0.219
15
25
4
75
70
0.228
16
25
5
75
60
0.175
17
25
4
75
70
0.22
18
20
3
75
70
0.157
19
25
4
80
80
0.166
20
30
4
75
60
0.158
21
25
4
80
60
0.152
22
25
4
75
70
0.215
23
20
5
75
70
0.161
24
20
4
75
80
0.177
25
20
4
70
70
0.2
26
25
5
80
70
0.147
27
25
3
75
60
0.139
28
25
3
70
70
0.163
29
25
3
75
80
0.159
表3.3云杉黄酮提取响应面试验设计及结果
试验号
A:
液料比
B:
提取时间
C:
提取温度
D:
乙醇体积分数
Y2吸光度值
ml/g
h
℃
%
1
30
3
75
70
0.106
2
25
4
70
60
0.117
3
30
5
75
70
0.128
4
25
5
70
70
0.118
5
25
4
75
70
0.159
6
25
5
75
80
0.12
7
20
4
75
60
0.131
8
20
4
80
70
0.121
9
25
3
80
70
0.126
10
30
4
75
80
0.128
11
25
4
70
80
0.133
12
30
4
70
70
0.126
13
30
4
80
70
0.137
14
25
4
75
70
0.148
15
25
4
75
70
0.161
16
25
5
75
60
0.123
17
25
4
75
70
0.156
18
20
3
75
70
0.115
19
25
4
80
80
0.124
20
30
4
75
60
0.123
21
25
4
80
60
0.136
22
25
4
75
70
0.157
23
20
5
75
70
0.111
24
20
4
75
80
0.123
25
20
4
70
70
0.126
26
25
5
80
70
0.103
27
25
3
75
60
0.117
28
25
3
70
70
0.114
29
25
3
75
80
0.099
表3.2和表3.3中分别的29个试验点为析因点和零点,在表3.2和表3.3中试验号第5、第14、第15、第17、第22为零点试验,其余试验号为析因试验.其中,析因点为自变量取值在A(液料比)、B(提取时间)、C(提取温度)、D(乙醇体积分数)所构成的三维顶点,零点为区域的中心点,零点试验重复5次用以估计试验误差。
将表3.2和表3.3试验数据用软件DesignExpert7.0.0进行多元回归分析,各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,而是复杂的多因素方程。
通过对显著性的分析,巴山冷杉数据结果采用None方程拟合,拟合效果最好;云杉数据结果采用Inverse方程拟合,拟合效果最好。
故通过分别两种计算方式得到可靠的分析结果。
巴山冷杉试验因素对响应值影响的回归方程为:
巴山冷杉吸光度Y1=0.04793A+0.3842B+0.1593C+0.06193D-0.00055AB+0.00011AC-0.000125AD-0.0002BC-0.00825BD-0.00005CD-0.000907A2-0.03705B2-0.001047C2-0.000353D2-9.288
云杉试验因素对响应值影响的回归方程为:
云杉吸光度Y2=1/(280.6-0.1094A-15.94B-5.032C-1.477D-0.09674AB-0.009652AC-0.00407AD+0.1035BC-0.03377BD+0.008699CD+0.02969A2+1.560B2+0.02828C2+0.007681D2)
4个试验因素均以量纲线性编码处理,方程中各项系数绝对值的大小能反映各因素对响应值的影响程度。
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- 云杉 冷杉 枝叶 中黄 酮类 物质 提取 研究