1、蛋白表达纯化实验步骤Word版蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。5、转化到DH5感受态细菌中扩增,提质粒。6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。7、蛋白的诱导表达。1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25M到1m
2、M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22m过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不
3、会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成50l一管,每次用一管,避免反复冻融。8、包涵体检测。方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法
4、宜受气泡影响。3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18左右),转速140rpm左右。4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。10、超声波裂解。1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。注意:1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。4.正常声音为:孜孜声,尖锐刺耳的声音
5、表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解60分钟,60分钟足够裂解。11、取得上清1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm,15min,4离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。(此时可以测量一下pH值,p
6、H值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。)12、纯化上清-摸洗脱条件。1)镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2)将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。(若是流速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。)取20l过柱后的样品,以备跑胶。3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶。注意:理论上是要将收集的溶液测量
7、280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。4)加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml(将前面的0.5ml单独接入EP管,再将后面的4ml接入另外两个EP管),留跑胶样品。5)加MES将NI柱重生。MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。(尿素可能对NI柱有损伤。)注意:所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer
8、pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。13、跑胶验证。1)跑2块0.75mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3)300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。(也可以300V,30min,只是图没有160V好看。)4)考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。5)脱色。先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。14、纯化上清-收集目的蛋
9、白1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。2)重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点(用160V),保存好。16、透析。1)配制2L透析液(配方见附件1),并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。3)用透析夹将透析袋夹住(将透析袋折叠一下会夹的更牢),将洗脱的蛋白样品加入其中,置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4冰箱1.
10、5h后换液。透析3次即可。注意:用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。17、浓缩。1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。4)透析袋用完后,洗净,保存于20%乙醇中4存放。注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现,由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀,要看仔细。如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分装后-
11、20度保存。18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。1)将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。2)配平。3)7400g,30min,4离心,结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间,以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。4)加入需要的蛋白储存液至4ml,离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可)助溶。5)收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中
12、,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白浓度(测量后),制备日期。注:超滤管的使用方法见附件419、蛋白浓度测定。见附件320、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。22、注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗体。24、抗体效价评定。附件1所需溶液配方:1)20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1L 0.5928 5.802192 17.5322)Equilibration Bu
13、ffer(平衡缓冲液): PBS with 10 mM 咪唑pH 7.43)Wash Buffer(清洗缓冲液): PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7.44)Elution Buffer(洗脱缓冲液): PBS with 250 mM 咪唑pH 7.45)MES(再生缓冲液): 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.6)透析袋处理液: 2%(w/v)碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7
14、)透析液:20mM PBS+50 mM NaCl(2.92g)试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1L 0.5928 5.802192 2.92gTIPS:14的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS,用500ml水将试剂溶解,取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中,作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分别加入适当体积的8M咪唑。最后,定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml,Equil
15、ibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。附件2包涵体检测1.摇10ml菌,加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温(16-25度)诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。在离心前取500l菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。2.诱导完成后,用2ml EP管6000rpm,2min,4度,收集10ml菌液。1.5ml PBS (50m MPBS,300m M NaCl )重悬细菌。3.裂解细胞。用超声波破碎细胞直到悬液变清亮,一般15到30
16、min。裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置。4.分离上清。5000rpm,4min,4除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后,10000rpm,10min,4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中,加5微5*SDS loading buffer混匀,煮沸10min。5.重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体,取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer,煮沸10min。6.正负对照的收集。离心收集正负对照菌体,0.5ml上清留下40l,加入10l5*SDSloadingbuffer,煮沸10min裂解。7.跑聚丙烯酰胺凝胶。将正
17、负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体.附件3蛋白浓度定量测试方案1.将染色剂稀释。稀释5倍,取4ml染色剂于50ml离心管中,加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44m 的滤膜过滤于另50ml离心管中。(此剂量可测4个样品。)2.牛血清白蛋白(BSA)标准品的制备1)将冻干的BSA溶于去离子水中,溶解成浓度为1mg/ml,分装为400-500l/支(可以室温放置60天,-20度长期保存)。2)将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml,各180l,另外加一管水为3.染色。1)取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支(其中4支为待
18、测样品)1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复,共8支,另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank,共10支EP管(或10+n支),分别对应标记。2)将30l样品和30l标准BSA及30l H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀。3)室温孵育5min到60min。5min后即开始测量,在60min内测完,越快越好,因为Absorbance wil increase over time。4. 吸光度的测量。600nm处测量,并记录吸光度。注意:1. blank是染色液加30微升的水。2.从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围,据此决定sample 的测量顺序。
19、5. 比色皿的洗涤。用100%乙醇浸泡洗涤。6. 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。附件4.4ml millipore超滤离心管使用注意事项1.用前用miliq 水润湿。2.4度预冷。3.离心力不能超过7500g。加速度设定为8.4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心,以使两膜所受的压力一致。5.使用完毕后,用miliq水洗净,加入1ml 0.1N NaOH泡24h,后加入1ml20%乙醇保存。如果要短期保存几天,也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法附件6.包涵体蛋白的提纯与提上清中所用试剂不同之处:在Equilibrat
20、ion Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后,离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片,再10000rpm15min离心,沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致,只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍。另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀,影响跑胶。这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。如果要做包涵体,建议用尿素做,因为盐酸胍的毒性较大,必须除去,除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小,可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好,较难溶解,可以用超声波破碎仪帮助溶解:6mm变幅杆,15%功率, 3s/6s,10min左右即可。也可以加上1%-5%的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer 中的。
