1、荧光定量PCR一、 样品RNA的抽提1.匀浆 将-80冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAiso Plus，并将组织样粉末覆盖。2.抽提 室温放置5min，使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中，室温静置5min，12000r/min，4离心15min；小心吸取上清液移入新离心管，加上清液的1/5体积量的氯仿，静置10min；12000 r/min，4离心10min。（此时分三层：无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相）； 3.RNA沉淀 吸取上清液移至新离心管，切勿吸
2、入中间蛋白层，向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min，4离心5min（此时底部会出现沉淀）；4.RNA洗涤 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1 ml的75%乙醇（用DEPC水或无酶无菌水配制，超净台中配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下12000r/min离心5分钟。5.RNA溶解 吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。加入无RNA酶的水20-40L用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。二、 RNA浓度和质量的测定1. 1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性：将从肌肉
3、中提取的总RNA吸取5，加入1L 6 X Loading Buffer,混匀，点入1%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，经凝胶成像系统检测条带。 2. 核酸蛋白分析仪检测OD；吸取2L的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度，A260A280在1.9-2.1之间，说明提取的总质量很好，记录稀释后RNA的Conc值（浓度）。三、 实时定量引物 实时定量引物根据NCBI公布的基因序列，依据实时定量引物设计原则，使用软件Primer5.0设计，管家基因引物引用参考文献所列，引物由上海生工有限公司合成。四、 反转录 宝生物（大连）工程有限公司TaKaRa Prime Script TMRT
4、 reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)进行反转录，体系及步骤如下； 1. 反转录制备cDNA第一链 采用SYBR Green qPCR法反转录，体系如表。试剂添加量（L）步骤的反应液10.0Prime Script RT Enzyme Mix1.0RT Primer Mix*41.05 X Prime Script Buffer（for Real Time）4.0RNase Free d H2O4.0Total20 按表成分在冰上配制反应液。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再
5、分装10到每个PCR反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。反转录条件；37 15min； 85 sec； 4 24。经过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/L，将反转录产物于冰箱中保存。 2. 实时定量PCR扩增 本试验应用CFX96TM Real-Time PCR Detection System扩増仪的操作方法。使用TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTM（TLi RNaseH Plus）进行实时定量PCR扩增。（1）实时定量PCR反应体系 以上一步反转录获得的cDNA为模板，按表组份配制反应液（反应液配制在冰上进行）。以GAPDH基因作为参照基因，对样品中MyHC、My
6、HC、MyHC、MyHC基因在RNA水平进行相对定量分析。目的基因与管家基因分别做-个平行样，每个岁龄的羊做10只平行，次重复。 PCR反应体系如表：（2）将配置好的反应体系装入12排八联管中，放入实时定量PCR仪中进行扩増。 设置反应条件为： （3）经扩増反应后，将产物于冰箱中保存。 3. PCR反应产物检验 吸取2L的PCR反应产物，加入6 X Loading Buffer混匀，点入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，用凝胶成像系统检测PCR反应产物的质量。 五、数据统计分析 实时定量PCR数据分析方法：本试验采用-法，计算公式：（）相对表达量（fold change）-t； （
7、）（目的基因-t内参基因）处理组-（t目的基因-t内参基因）未处理组。 1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。（1）浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5 l，1:100稀释至495 l的TE中，测得A260= 0.21 RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/
8、l取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 l 0.84 g/l = 29.4 g（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)10MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4 M MOPS，pH 7.00.1 M 乙酸钠0.01 M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几
9、个毫米。（2）准备RNA样品取3 gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRN
10、A和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。三、样品cDNA合成1. 反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录buffer 2 l2 上游引物 0.2 l3 下游引物 0.2 l4 dNTP 0.1 l5 逆转录酶MMLV 0.5 l6 DEPC水 5 l7 RNA模版 2 l8 总体积 10 l轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录
11、酶0.5 l，37水浴60分钟。3. 取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR1. -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 l按10倍稀释（加水27 l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2. 反应体系如下：标准品反应体系序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 l2 阳性模板上游引物F 0.5 l3 阳性模板下游引物R 0.5 l4 dNTP 0.5 l5 Taq酶 1 l6 阳
12、性模板DNA 5 l7 ddH2O 32.5 l8 总体积 50 l轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。3. 管家基因反应体系：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 l2 内参照上游引物F 0.5 l3 内参照下游引物R 0.5 l4 dNTP 0.5 l5 Taq酶 1 l6 待测样品cDNA 5 l7 ddH2O 32.5 l8 总体积 50 l轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1.
13、针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。2. 反应体系序号 反应物 剂量1 10 PCR缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94 1分钟；551分钟；721分钟）； 72延伸5分钟。（3）PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。（4）将PCR产物进行10倍
14、梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、 待测样品的待测基因实时定量PCR1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。2. 体系配置如下：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1 ul3 下游引物 1 ul4 dNTP 1 ul5 Taq聚合酶 2 ul6 待测样品cDNA 5 ul7 ddH2O 30 ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。（3）将配制好的PCR反应溶液置于Real time P
15、CR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93 2分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。七、 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Real time PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，Gold View染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。PCR-SSCP分析的基本程序为：首先P
16、CR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DN
17、A区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加
18、入-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。一、试剂准备PCR相关试剂-32P-dCTP30聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 保存。10过硫酸铵配制方法：1g 过硫酸铵，溶于10ml ddH2O
19、中，4 OC保存（可用数周）。TEMED（N，N，N，N，N-四甲基乙二胺） 5TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7变性上样液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步骤 PCR扩增反应总体积为10l，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：10buffer 1ldNTPmix 70MDNA模板 100ng引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入-32P-dCTP 0.1l加ddH2O至10l按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。 聚
20、丙烯酰胺凝胶电泳 电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95乙醇擦拭，自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上， 510min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。 制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用58的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气（开始时要缓慢）除气泡，加 35l TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液，将玻璃模具倾斜成60O角，缓慢注
21、入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳子时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去，放入电泳槽，凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入 1TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。 扩增产物的处理：将 PCR扩增产物与变性上样液按1：5的比例加入0.5ml微量离心管中，混匀。样品上胶前应98变性10min，立即冰浴
22、骤冷。取约35l变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。 电泳：电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l5Vcm电泳。 剥胶：电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。放
23、射自显影：在暗室中将X线片贴于胶面，盖严片夹，用黑布将X线片夹包裹，置-70OC放射自显影。曝光时间根据同位素的强度而定，约 24h10d。 冲洗胶片从-70oC取出X线片夹，在暗室内迅速取出X线片，立即显影，以免使X线片上出现过多的冷凝水。（如果想再得到一张放射自显影影像，可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温，并擦去冷凝水后再装入新的X线片）。依次按以下程序操作进行显影：X线片显影液显影 1-5min水洗 lmin定影液定影 5min流动水冲洗 15min所有使用液的温度应为1820OC为宜。三、注
24、意事项 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，SSCP可发现其中70的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片段，则仅能检出103O的变异，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。
25、也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用23种条件做SSCP，可能提高敏感性。 电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为
26、确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。 凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。 凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重要，一般使用58的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。 假阴性: 一般认为，如没有污染，PCRSSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致
27、，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。8. 结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带因此，PCRSSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。
