1、果酒酿造实验报告果酒酵母的分离纯化和选育一、实验目的和内容 1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法； 2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。二、实验原理酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 712m，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果
2、酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。三、实验仪器与材料样品：新鲜水果榨汁。YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. PDA培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121灭菌30分钟。）PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0 g，MgSO47H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至10
3、00ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。发酵培养基：蔗糖200克，磷酸氢二钾1克，酵母膏10克，硫酸铵1克，七水硫酸镁1克。器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。4、实验方法（1）获得菌种 配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品好的苹果、腐果果皮若干，将腐果，好果部分皮装入将富集培养液，各三份接种，120r/min，28摇床培养4天。用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，2
4、8恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。2酵母菌种的复筛 选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL果汁，置于80的水浴杀菌5min，冷却到30后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子
5、液，在20 下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。3酵母菌的耐受性试验 采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16% 、18% 、20% ）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。活化
6、条件：28 条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h发酵条件：28条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；接种量：1107 cfu/mL。（1）耐酒精度试验 采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml， 再以水果原汁为培养基， 制成含酒精量为10%、12%、14%、16% 、18%系列的液体培养基。按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标10、12
7、、14、16、18，按下表每管加入果汁量：试管编号010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培养液含酒精%（v/v）0101214161820（2） 耐SO2试验 按亚硫酸含量为6% 计， 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。 按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量6%），加完后摇匀。最后在每发
8、酵管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号012345亚硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培养液含SO2mg/L060100120180240发酵3-4天，观察记录发泡状况，用加号表示发泡多少，选择耐二氧化硫和酒精度都较高的菌株做保藏，供以后利用。5、技术指标（1）随着菌种的发酵，质量会降低，降低的越快，发酵速率越高根据它质量随时间的变化曲线可以了解它发酵速度的快慢（2）酒精，二氧化硫对菌种有抑制作用，表现为发泡少，综合比较两种对发酵的抑制作用大
9、小，选择耐受性较高的菌株做保藏。6、分析实验数据，讨论结果。果酒酵母的发酵1、实验目的、意义1掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。2用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。2、实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、
10、乙醛等许多中间产物。果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。3、实验材料样品：新鲜水果及压榨汁。试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土；器皿：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰
11、箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.51.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30 ），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。4、实验方法（1）果酒酿造的工艺流程 鲜果分选破碎、除梗果浆分离取汁澄清清汁 发酵倒桶贮酒过滤冷处理调配过滤成品 （2）工艺简述 1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。破碎、除梗： 破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。二氧化硫处
12、理： 二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。（以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：葡萄果实70%60/0.061000。）此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加 。2）果汁的调整： 取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。糖的
13、调整： 酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。酸的调整： 酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。 发酵调整后的果汁里加上酵母菌,于28度温度下培养一周，每天测含糖量，含酸量，分别制成曲线。发酵结束后用蒸馏设备将酒蒸出，并用酒度计测量酒度。另外：糖的滴定实验1. 实验目的 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖
14、的方法。2. 实验原理 斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O（砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。3. 实验材料和用具1）试剂费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO45H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。0.25葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长）
15、，用蒸馏水稀释到1000ml。2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。4. 操作步骤1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和比预备试验少 1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标
16、准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。计算式中： F费林溶液A、B各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；m称取葡萄糖的质量，g；V消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。3）苹果酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于 100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为 0.20.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（5）计算。式中
17、：X总糖或还原糖的含量，gL；F费林溶液、各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；V1吸取的样品体积，mL；V2样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3消耗试样的体积，mL；G葡萄糖标准溶液的准确浓度，gmL；V消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果应表示至一位小数。滴定酸的测定中和滴定法1. 实验目的和内容 （1）采用中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。 （2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。以g/L报告其结果，测定值保留一位小数。2. 实验原理 利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶
18、液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。3. 试剂 酚酞指示剂溶液，10g/L ：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)0.1mol/L。 （1）配制 将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。 （2）标定 称取0.6 g于105110 烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001 g。溶于50 mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红
19、色为其终点。同时做空白试验。 （3）计算 按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C m/(V1-V2) 0.2042 式中：C 氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； m 基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V 滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1 空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042与1.00mL氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。 4. 操作步骤（1）样品的测定 取调温至20 的样品2.00-5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立
20、即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。 起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。 （2）空白的测定 吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。（3）结果计算 按下式计算滴定酸的量，以g/L表示： 式中：X 样品中滴定酸的含量，g/L；c 氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1 样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0 空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； V2 吸取样品的体积，mL； Si 与1.00mL氢氧化钠标
21、准溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的，以克表示的试样主体酸的质量。 S酒石酸0.075；S苹果酸0.067；S柠檬酸0.064；S草酸0.045酒度的测定1. 实验目的和内容（1）采用酒精计法测定葡萄酒(果酒)中酒精度。 （2）适用于各种类型葡萄酒(果酒)中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%(v/v)，保留一位小数。2. 实验原理 以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20时乙醇的体积百分数，即酒精度。3. 实验材料 全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。4. 操作步骤（1）用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100mL（
22、具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温20）于500mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL ( 2)将试样倒入洁净、干燥的100mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20时酒精度。所得结果表示至一位小数。5、技术指标（1）还原糖能产生酒精，所以可以用苹果酿酒。（2）二氧化硫有还原性，果汁里面放二氧化硫可以阻止果汁被氧化。（3）随着发酵进行，果汁当中的含糖量减少，含酸量增加，可以将其制成曲线，显示其随时间变化。6、分析数据，讨论结果
