1、cRGDsiEGFR分子肿瘤靶向性及其抗恶性胶质瘤的体内外作用研究cRGD-siEGFR分子肿瘤靶向性及其抗恶性胶质瘤的体内外作用研究研究背景近年来癌症已成为威胁人类生命与健康的主要致死疾病,对癌症的有效防治已是全球共同面临的难题。目前,手术、放化疗是治疗癌症的常规手段,但存在不良反应多、对人体损伤大以及治疗效果不理想等问题。近年来,新型的肿瘤分子靶向药物逐渐进入临床,因其具有特异性强、耐受性好、毒副作用相对小等特点,分子靶向药物已成为临床治疗肿瘤的重要手段。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种细胞外蛋白配体的细胞表面受体。已有
2、大量研究表明,EGFR的异常表达,可激活与肿瘤增殖、分化相关的基因,在肿瘤的发生和发展过程中起着极其重要的作用。目前靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是当今肿瘤药物研发的重要方向。临床上针对EGFR的肿瘤靶向药物主要分三类：小分子靶向药物、单克隆抗体和肿瘤疫苗,如常用的西妥昔单抗、帕尼单抗等。肿瘤靶向药物的问世为临床治疗肿瘤发挥了巨大的作用,但随着临床的广泛应用,与这些靶向药物相关的严重不良反应不断涌现,且逐渐产生的耐药性问题已成为肿瘤靶向药物研究的又一个挑战,如何满足迫切的临床需求,研发新型的肿瘤靶向药物变得尤为重要。RNA干扰(RNA interference, RNAi)
3、是近年发展起来的一种新技术。RNAi是指通过外源性或内源性的双链RNA在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解,进而发挥特异性的基因沉默作用,目前全球已有近60个关于肿瘤和病毒感染的siRNA药物进入到临床试验阶段,RNAi作为一种全新的药物分子展示了巨大的临床应用前景。通过搜索国际上重要的临床试验注册数据库,如美国ClinicalTrials.gov、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,因此利用现代生物学技术开发针对EGFR为靶点的siRNA药物具有一定的研究价值和创新性,而且还蕴藏着巨大的潜力和临床应用前景。整合素(integrin
4、)是一种介导细胞核与外环境之间连接的跨膜受体。作为细胞粘附分子家族的重要成员之一,主要介导细胞之间、细胞与胞外基质之间的粘附,在许多恶性肿瘤细胞表面高表达,但在大多数正常的静止期细胞和组织中几乎不表达,其亚型为v3,。现有研究已证实多肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)可以被v3受体特异性的识别,且环状RGD (cRGD)对v3受体的亲和力、特异性更高。因此,可以利用cRGD与肿瘤细胞表面高表达的v3受体特异性结合、经受体内吞携带药物分子进入细胞内的特点,人工合cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR mRNA表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临
5、床价值。综上所述,我国恶性肿瘤患者日益增加,目前尚无治愈肿瘤的特效药物,常规的治疗手段毒副作用大,疗效不理想,新型的肿瘤靶向药物虽然从一定程度上显示了临床疗效,但仍存在较多严重不良反应,而且现有的靶向药物仅局限于非小细胞肺癌和乳腺癌等几个病症,加上日益严重的耐药问题已成为这些药物的应用瓶颈,更多的新型肿瘤靶向药物亟待开发,新兴的RNAi技术为新型肿瘤靶向药物的研究提供了新的手段,为新型高效低毒的肿瘤靶向药物研发带来了希望。目前国际上重要的临床试验注册数据库ClinicalTrials.gov、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,参考文
6、献中也未见以cRGD为靶向配体、EGFR为靶点的siRNA药物研究报道,因此通过人工合成cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临床价值。本论文拟将cRGD肽通过小分子量PEG接头直接共价偶联到特异性沉默EGFR siRNA正义链的末端,得到可特异性沉默肿瘤细胞EGFR mRNA表达的cRGD-siEGFR分子,并考察该分子特异性沉默EGFR mRNA和蛋白的作用、肿瘤靶向性、抗肿瘤活性及其毒副作用和免疫刺激反应,并进一步对肿瘤组织切片,进行免疫组化和TUNEL分析,验证cRGD-siEGFR分子抑制肿瘤细胞增值
7、、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,以及对机体各脏器和组织的毒副作用,探讨cRGD-siEGFR分子作为新型肿瘤分子靶向药物的可行性及其存在的优缺点,也为类似的RNAi药物研究提供参考。目的1.筛选验证有效沉默EGFR mRNA表达的siRNA序列及其骨架修饰方式。2.合成cRGD-siEGFR分子并且对其结构和纯度进行鉴定分析。3.体外研究cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性。4.体外研究cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性,细胞毒性及其特异性沉默EGFR mRNA表达的功能。5.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子的肿瘤靶向性及其在体内的代谢分布。6.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子
8、抗肿瘤生长的生物学活性及其相关机制(基因沉默效率和肿瘤细胞凋亡情况)；7.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子对免疫原性和肝肾功能的影响。方法1. EGFR siRNA序列验证和骨架修饰通过RT-qPCR法进行对EGFR siRNA序列沉默EGFR mRNA的效率进行验证,并对验证后的序列进行骨架修饰,主要通过对EGFR siRNA正义链或反义链的5或3端进行甲氧基修饰以及关键位置的U替换为T,以提高siRNA的稳定性,降低免疫原性和脱靶效应。2. cRGD-siEGFR分子的合成将cRGD肽的氨基与8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(PEG)的羧基脱水缩合,得到cRGD-PEG,再与3-Mal
9、eimidopropionic Acid (MPA)的羧基脱水缩合,得到cRGD-PEG-MPA,最后通过巯基与EGFR siRNA分子正义链的5端共轭连接,得到人工合成的cRGD-siEGFR。LC-MS对合成的cRGD-siEGFR进行结构鉴定,高效液相色谱(HPLC)检测cRGD-siRNA分子的合成纯度。3. cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性未经修饰siRNA、不同骨架修饰EGFR siRNA、以及合成的双链cRGD-siEGFR分子,与小鼠新鲜血浆1：1混合,在37条件孵育不同时间后,采用1.2%琼脂糖凝胶电泳测定其稳定性。4. cRGD-siEGFR分子体外生物学功能研究CC
10、K-8法评价cRGD-siRNA分子的体外细胞毒性。共聚焦显微镜检测Cy5标记siRNA分子在细胞中的分布,以此验证cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性。RT-qPCR和western blot评价cRGD-siEGFR分子在细胞水平抑制EGFR mRNA和EGFR蛋白表达的作用。流式细胞术定量检测U87 MG细胞对cRGD-siEGFR-cy5的摄取能力。CCK-8和EDU实验考察cRGD-siEGFR抑制U87MG细胞的增殖作用。流式细胞术测定cRGD-siEGFR诱导U87 MG细胞凋亡的作用。5. cRGD-siEGFR分子在体内的肿瘤靶向性及其代谢分布。成功建立肿瘤裸鼠模型后,尾静
11、脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (lnmol/20g)和EGFR siRNA (lnmol/20g)。分别在12h、24h、48h、72h进行活体成像。72h后颈椎脱臼法处死小鼠,迅速解剖取出肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾并进行荧光成像,观察各离体器官内siRNA的分布情况。激发波长和发射波长分别为640nm和680nm,6. cRGD-siEGFR分子的肿瘤组织靶向性。将实验动物随机分为3组,每组3只裸鼠,分别为U87 MG肿瘤模型cRGD-siEGFR组(A组)、U87 MG肿瘤模型裸siRNA组(B组)、Hela肿瘤模型cRGD-siEGFR组(C组)。当裸鼠肿瘤体积长到约150
12、mm3时,开始给药,A组尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (1nmol/20g)、B组尾静脉注射Cy5标记的裸EGFR siRNA组(1nmol/20g)、C组尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (1nmol/20g),给药24h后水合氯醛(5%,120ul/20g)麻醉裸鼠取材处理,切片染色,显微镜观察cRGD-siEGFR在组织中的分布,评价cRGD-siEGFR分子的肿瘤组织靶向性。7. cRGD-siEGFR分子抗肿瘤生物学活性成功建立裸鼠肿瘤模型后,待裸鼠肿瘤体积长到约150mm3时,尾静脉注射给药。A组为正常对照组,给予生理盐水(125l/20g)、B组cRG
13、D-siNC组(5nmol/20g)、C组cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)、D组cRGD-siEGFR(1.5 nmol/20g)、E组为混合给药组cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)+cRGD-siEGFR (1.5 nmol/20g)、F组cRGD-siEGFR(5 nmol/20g)。每间隔48h给药一次,一共给药7次,在每次给药前和最后麻醉前测量荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积,计算公式：V=ab20.5(a为长直径,b为短直径),最后一次给药3天后,水合氯醛(5%,120ul/20g)麻醉裸鼠取材,摘眼球法取血,分离血清；解剖分离肿瘤组织,液氮保存,分别
14、用于qRT-PCR, Western Blot、TUNEL染色和免疫组化检测。8. cRGD-siEGFR分子的免疫原性和肝肾毒性考察采用Elisa测定以上各组裸鼠血清中IFN-、IL-6、IFN-和IL-12的含量,以及谷丙转氨酶和肌酐含量,与正常对照组和阴性对照进行比较。进一步解剖摘取各组裸鼠心、肝、脾、肾进行病理切片,HE染色观察,与正常组进行比较。结果1. EGFR siRNA序列验证和骨架修饰经筛选验证,发现sense strand:5-CAA AGU GUG UAA CGG A AUA dTdT-3; antisense strand:5-UAU UCC GUU ACA CAC U
15、UUG dTdT -3 的 EGFR siRNA序列具有较好的沉默效应,沉默EGFR mRNA的效率可达80%以上。确定了siRNA序列的骨架修饰方法,即在正义链和反义链的两端的三个碱基进行甲氧基修饰,可显著提高EGFR siRNA的稳定性,且不降低其沉默效率。2. cRGD-siEGFR分子的合成LC-MS鉴定结果表明,合成的cRGD-siEGFR分子质量与理论分子质量一致,证明合成成功。反相HPLC的纯度分析结果表明cRGD-siEGFR分子的纯度可达88.0%。3. cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性实验结果表明,裸EGFR siRNA在血浆中稳定性较差,12h后大量降解,24h全部
16、降解；第三种骨架修饰方式(即在正义链和反义链的两端的三个碱基进行甲氧基修饰)siRNA的稳定性最好,36h后仍有少量siRNA未被降解；cRGD-siRNA分子结构最稳定,到48小时仅有部分降解。4. cRGD-siEGFR分子体外生物学功能研究(1)CCK-8实验结果表明cRGD-siRNA分子细胞毒性非常小。当cRGD-siRNA给药浓度达到1500nM时,共培养24h后,细胞活性仍达到90.56%,浓度增大到2000nM时,细胞活性仍可达到82.92%。(2)共聚焦显微镜观察cRGD-siEGFR对U87 MG细胞的特异性靶向作用。cRGD-siEGFR可较好的将EGFR siRNA递送
17、进入细胞内。而裸siRNA无法进入细胞内部,经RAD特异性封闭v3受体后,cRGD-siEGFR也无法进入细胞内,表明cRGD-siEGFR可特异性的靶向高表达av3受体的肿瘤细胞,如U87 MG细胞系。(3) RT-qPCR实验结果表明,与control组的EGFR mRNA表达水平相比,转染浓度100nM和200nM时cRGD-siEGFR沉默效率较低,分别为2.55%和15.10%,与Control组相比不存在统计学差异(P=0.809和P=0.073)。与Control组相比,500nM、800nM、1000nM和lipo 2000/siRNA组的EGFR mRNA表达水平均显著下调,
18、表达量分别为：47.39%、21.93%、13.34%和18.57%,且均有显著差异(P<0.01)。从转染的剂量可以看出,随着浓度梯度的增大,cRGD-siEGFR分子的沉默效率逐渐增大,但达到1000nM时,其沉默效率超过了阳性对照lipo2000/siRNA组,且存在统计学差异(P=0.034)。(4) Western Blot实验结果表明,与control组的EGFR蛋白表达水平相比,裸siRNA组和cRGD-siNC组不存在统计学差异(P>0.05)。cRGD-siEGFR和lipo 2000/siRNA的EGFR蛋白表达水平显著低于control组,分别为26.47%和
19、15.04%(P<0.01)。表明cRGD-siEGFR可有效沉默U87 MG细胞内EGFR蛋白表达。(5)流式细胞术实验结果表明,裸siRNA几乎不能进入U87 MG细胞内,Cy5阳性率仅为1.27%,荧光强度11.67,这与共聚焦显微镜的结果一致。与裸siRNA-Cy5组相比较,U87 MG对cRGD-siEGFR-cy5(100nM)、cRGD-siEGFR-cy5 (400nM)和lipo2000/siRNA-cy5的摄取能力较好,摄取阳性率分别为97.97%,98.68%和98.58%,平均荧光强度分别为347.00,1145.00和3133.67。且随着给药剂量增加,摄取量也
20、相应增加,400nM的cRGD-siEGFR-cy5其摄取量是100nM剂量组的4倍,但相对于lipo2000/siRNA-cy5组,U87 MG对cRGD-siEGFR-cy5摄取量相对较低,只有lipo2000/siRNA-cy5组摄取量的35%。(6)CCK-8实验结果表明,不同浓度cRGD-siEGFR分子(400 nM、600nM、800 nM)在48h和72h均具有抑制U87 MG细胞增殖的作用,48h各浓度组细胞增殖活性依次为(77.1110.19)%、(61.1312.20)%、(44.527.35)%,72h各浓度组细胞增殖活性依次为(68.609.23)%、(52.118.
21、21)%、(33.746.84)%,与Control组相比均具有统计学差异(P<0.01)。EDU实验结果与CCK-8实验结果一致。(7)流式细胞术实验结果表明不同浓度的cRGD-siEGFR(400 nM、600 nM、 800 nM)均可不同程度的诱导U87 MG细胞产生凋亡,凋亡率分别为(26.595.87)%,(45.236.99)%和(53.887.38)%,与Control和阴性组相比,均具有统计学差异(P<0.05)。5. cRGD-siRNA分子在体内的肿瘤靶向性及其代谢分布。裸鼠活体成像结果显示经小鼠尾静脉注射1nmol的cRGD-siEGFR分子(Cy5标记),
22、cRGD-siEGFR分子可特异性靶向肿瘤部位。在12h、24h时肿瘤部位有大量Cy5荧光表达,在肾脏组织中也有较多的Cy5荧光表达,其次在肝脏中也有少量表达。而裸siRNA (Cy-5标记)在肿瘤部位12h、24h均未见Cy5荧光表达,在肾脏和肝脏有较高表达。解剖后,裸鼠的活体组织器官成像的结果和各解剖组织器官结果相一致,均显示cRGD-siEGFR分子可特异性靶向肿瘤组织。进一步延长时间观察结果显示,24h之后在肿瘤部位和肾脏的荧光表达逐渐降低,48h时肝脏基本无荧光表达,72h时肿瘤部位和肾脏的荧光表达量已经非常小；72h时裸siRNA (Cy-5标记)在肿瘤部位始终未见分布。解剖后,裸
23、鼠的活体组织器官成像结果和解剖后各组织器官成像结果一致,表明cRGD-siEGFR的稳定性较好,48h时肿瘤部位仍有较高荧光表达,72h肿瘤部位仍有少量荧光表达,主要代谢部位为肾脏,其次为肝脏。6. cRGD-siRNA分子的肿瘤组织靶向性。尾静脉注射1 nmol裸siRNA和cRGD-siEGFR分子后,cRGD-siEGFR分子可通过肿瘤血管,渗入到肿瘤组织间质中,而裸siRNA无法进入肿瘤部位,在不表达v3受体的正常组织和Hela肿瘤组织中,cRGD-siEGFR分子无法达到肿瘤部位,进一步在裸鼠体内证实cRGD-siEGFR分子可特异性靶向高表达v3受体的肿瘤部位,并渗入肿瘤间质。7.
24、 cRGD-siRNA分子的抗肿瘤生物学活性尾静脉注射,连续给药7次,每间隔48h给药一次,每次注射前测量肿瘤体积和体重,最后一次给药3天后,再次测量肿瘤体积和体重,处死裸鼠,分离肿瘤,生理盐水洗净,滤纸吸干水分,拍照,称重。统计学分析各组荷瘤裸鼠肿瘤体积和瘤重变化情况,结果显示仅高剂量的cRGD-siEGFR (5nmol/20g)才能显著抑制肿瘤生长,低剂量的cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)和cRGD-siEGFR (1.5nmol/20g)具有抑制肿瘤生长的趋势,但无显著差异。RT-qPCR和Western Blot实验结果表明,cRGD-siEGFR (1.5nm
25、ol)组、cRGD-siVegfr2 (1.5nmol)+ cRGD-siEGFR (1.5nmol)联合给药组和cRGD-siEGFR (5nmol)组可明显降低肿瘤组织中EGFR mRNA和蛋白的表达水平,但cRGD-siEGFR (5nmol)作用最强,可到达约50%的体内沉默效率。Tunel染色结果表明,高剂量的cRGD-siEGFR (5nmol/20g)能明显诱导肿瘤细胞凋亡,低剂量的cRGD-siVegfr2 (1.5 nmol/20g)和cRGD-siEGFR (1.5nmol/20g)具有一定的诱导肿瘤细胞凋亡作用。8. cRGD-siEGFR分子的免疫原性和肝肾毒性考察El
26、isa和血生化实验结果表明,与对照组相比,cRGD-siRNA组细胞因子IFN-, IFN-, IL-6和IL-12,肌酐和丙氨酸转氨酶均无统计学差异(P>0.05)。表明cRGD-siEGFR免疫原性和毒性较小。病理切片结果进一步表明,cRGD-siRNA毒性小,即使高剂量(5nmol)连续给药7次后(间隔48h一次),对机体各脏器也未见明显毒性作用。结论通过将cRGD肽与小分子量PEG接头直接共价偶联到EGFR siRNA正义链末端,成功合成了cRGD-siEGFR分子,体外和体内的研究结果表明cRGD-siEGFR分子可特异性的靶向肿瘤部位,并进入肿瘤间质,特异性沉默EGFR mRNA的表达,并显著抑制肿瘤的生长,具有较好的临床研究前景。
