1、香菇中糖类物质的分离与测定香菇中糖类物质的分离与测定摘要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取香菇多糖（Lentinan，LNT），利用正交法得出最佳提取粗多糖的方案，得到的粗多糖回收率为14.05，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。用苯酚硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为35.9%；经过薄层层析和纸层析法分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖；用Sepharsose CL6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为5597.58道尔顿。气象色谱分析单糖含的结果是香菇多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖等，其中含量较多的半乳糖和葡萄糖。关键字：香菇多糖
2、 回收率 含量 组成 相对分子量Separation and Determination of carbohydrates in Lentinus edodes Abstract：This experiment extracts of lentinan (Lentinan LNT) by using hot water extraction and ethanol alcohol precipitation method. The orthogonal method to get the optimum extraction of polysaccharides is the best pro
3、gram, resulting polysaccharides recovery of 14.05%, and then to get crude polysaccharide qualitative and quantitative analysis. By using Phenol-sulfuric acid method, extracted polysaccharides single oligosaccharides and polysaccharides content was 35.9%; TLC and paper chromatography analysis monosac
4、charide composition, the monosaccharide composes mostly of glucose and arabinose; Relative molecular weight of polysaccharide determined by Sepharsose CL-6B column chromatography is about 5597.58 daltons.The results of gas chromatographic analysis of a monosaccharide is galactose, glucose, arabinose
5、, fucose, sugar, and other types of monosaccharides in the lentinan. galactose and glucose are much more among them.Key words： Lentinan; Recoveries; Content; Composition; Relative molecular weight0 引言：糖类化合物是中药的重要成分，随着现代生物化学与分子生物学的不断发展与进步，人们对糖的了解越来越多。而糖生物学研究对揭示生命本质，实现中药现代化，深入开发中药资源有着重要的意义。但是,目前多糖的研究主
6、要以陆生植物为主, 有些源于名贵中药,这不利于多糖应用与研究的进一步发展。因此物美价廉的香菇受到越来越多的关注。香菇（Lentinus edodes）是侧耳科（Pleara taco）的担子菌，含有多种有效药用成分。尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种宿主免疫增强剂（Host defense-tiator，HDP），它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本团队以热水提取法获得香菇多糖（Lentinan，LNT），并对其理化性质，含量和组成进行了一定规模的研究分析，为香菇多糖的开发与利用提供了实验依据。1 材料与方法1.1 实验材料 材料：香菇 试剂（1）无水乙醇
7、 （2）无水乙醚 （3）P2O5 （4）浓硫酸（5）6%苯酚 （6）葡萄糖 （7）BaCO3 （8）显色剂：苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液 展层剂：正丁醇：乙醇：水=4:1:5（体积比）标准糖样：甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖等琼脂糖凝胶 （12）洗脱液：生理盐水（9g /ml ）蓝色葡聚糖及不同相对分子质量葡聚糖标准样仪器（1）电子天平 （2）烧杯 （3）玻璃棒 （4）恒温水浴锅 （5）纱布 （6）容量瓶 （7）真空干燥器 （8）分析天平（9）移液管 （10）可见光分光光度计 （11）水解管 （12）滤纸 （13）漏斗 （14）毛细管 （15）硅胶板（16）层析缸 （17）烘箱（18）喷雾剂
8、 （19）层析柱1cm90cm （20）恒流泵 （21）记录仪 （22）自动部分收集器（23）紫外检测仪 1.2 香菇中多糖的提取称取晒干的香菇30.32g，用剪刀剪碎成小块，用自来水浸泡约24h后，在80下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。 游离的单寡糖多糖中的己糖、糖醛酸在浓硫酸作用下，可脱水生
9、成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。己糖生成的化合物在490nm波长处有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系。因此可以通过测定单糖的吸收值来测定单糖的含量。利用此原理便可测定香菇中单糖的含量。 标准曲线的制定本实验的以葡萄糖为标准制定标准曲线，按照如下表格试剂量，分别向6个试管中加入不同量的试剂，并立即摇匀，室温放置10min后于490nm处测定光吸收值，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光吸收值，绘制葡萄糖微克数与光吸收值之间的标准曲线。试管编号葡萄糖/ml蒸馏水/ml6%苯酚/ml浓硫酸/mlA490nm00123450香菇中单寡糖与多糖含量测定将待测样品称取5mg，水溶并定容至
10、50ml，然后取干燥洁净试管，将5mg/50ml待测样品、6%苯酚溶液、浓硫酸依次按照：的比例加入，混匀。冷却10min后，静置，以蒸馏水代替糖溶液作对照，在490nm下比色，并做3个重复。所得数值取平均值，对照标准曲线可得单寡糖与多糖含量。1.4 香菇多糖的单糖组成分析薄层层析与纸层析分析法本实验采用2种方法来测定香菇多糖中单糖种类，薄层层析法与纸层析法。薄层层析是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，以液体为流动相的一种层析方法，利用固定相对物质的吸附能力不同而使物质得到分离。本实验应用吸附薄层层析法，即以硅胶为吸附剂。根据同一块硅胶板中糖的Rf与标准糖的Rf相比较，即可对单糖的组成进行鉴定
11、。其中溶质的移动速率Rf等于原点到层析斑点中心的距离与原点到溶剂前缘的距离的比值。纸层析法是以纸为载体分离不同物质的方法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为层析液，根据相同时间内不同样品与标准样移动的距离来确定单糖种类。薄层层析分析法（纸层析方法与此相同，不再赘述）.1香菇多糖酸水解将20mg待测糖样加1mol/l浓硫酸2ml，封管，100水解8h，固体BaCO3中和，过滤，浓缩至1ml。.2 点样点样时将硅胶板水平放置，用毛细管在预先标好的位置上（如制板前，在距硅胶板一段2cm处用铅笔画一直线，在直线上，以间隔打点作为点样位置）分别点上标准样及待测糖样，点样斑点尽可能小，直径不大于4m
12、m。待干后，重复点样34次，且待测糖样要点在中间。.3 展层将硅胶板放进层析缸内，点样端靠近展层剂，贮液槽内加入展层剂，硅胶板在此密封层析装置中展层。.4 染色待展层剂到达离层析板上沿12cm时，取出层析板，记录溶剂前沿，置60烘箱中烘干。后用喷雾器向硅胶板上喷洒显色剂（苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）再经100显色15min，即显色各层析斑点。.5 计算相对迁移率Rf测定每个斑点中心距加样原点的迁移距离，计算相对迁移率Rf。通过Rf判断样品中含有的单糖种类。1.5 香菇多糖相对分子质量分布分析 Sepharose CL-6B柱层析法本实验主要采用凝胶过滤色谱对所提取的多糖进行相对分子的检测
13、。凝胶过滤层析主要根据小分子可以进入凝胶网孔，移动进程长;大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，将随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙洗脱下来，移动路程短，迁移的速度快，这样就可以实现我们分离的目的。本小组首先使用了两个标准样，根据其洗脱体积和相对分子质量制作标准曲线，之后再根据待测样的洗脱体积，得出待测样的相对分子质量，详细步骤如下：凝胶浸泡将琼脂糖凝胶用乙醇浸泡，胀后倒去不易沉下的较细颗粒。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h ，搅拌后继续除去悬浮的较细颗粒。装柱将琼脂糖凝胶分析住垂直装好，关闭出口，加入10cm缓冲液。将处理好的凝胶用等体积的洗脱液搅拌成浆状，自柱顶部沿管壁缓慢加入，待底
14、部凝胶体积约1cm 高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至刻度线（80cm）即可。装柱要求连续、均匀、无气泡。平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用23倍体积洗脱液进行洗脱和平衡（22.2./10min /管）加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml 样品（第一次加样为相对分子质量为万，第二次为万，第三次为待测样）沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液面4cm 左右，接上恒流泵，调好流速（流速为22.2ml /10min /管），用9g /lnacl 溶液开始洗
15、脱。收集与测定以BS-100A自动部分收集器收集，苯酚-硫酸法测定糖的分布，进而根据洗脱体积制作标准曲线。进而求出待测样品的相对分子质量。1.6 气相色谱法测定单糖含量 多糖乙酰化方法1.6.1 阳离子交换树脂的处理方法：95%的乙醇洗数次后浸泡过夜，80度烘干1M盐酸浸泡过夜，水洗至中性，烘干。1.6.2 水解管验漏每只水解管中加入1ml无水乙醇，在相应位置划上线，盖紧盖子，烘箱中1203h，隔一会就要看一下，如果有漏的很快无水乙醇就会挥发，这个时候应该换换盖子，或者在盖子中加两个橡胶塞子，直到有相应个水解管不漏为止。验漏后，用胶布给每个水解管都编上号，管身和盖子上都要标记，这非常重要。倒掉
16、无水乙醇，洗衣粉洗干净，大量清水冲洗，再用蒸馏水冲洗，烘干。1.6.3 水解称取20mg粗多糖于水解管中，加入1ml三氟乙酸，拧紧盖子，烘箱中1203h，要划线，开始的时候要观察是否漏，若挥发，补加三氟乙酸，但浓度会变，尽量不要使其漏。1.6.4 赶酸拿出水解管，凉一会儿，将样品转移至蒸发皿中，蒸发皿一定要刷干净，否则后续实验中一顿刮，肯定会影响实验结果，蒸发皿要做好标记，不要弄乱。用尽量少的无水乙醇将水解管洗干净，并转移至蒸发皿中，不断加入无水乙醇，以致PH至中性。无水乙醇也达不到中性，PH和其一致就行，1ml蓝色枪头上套一个红色的胶塞成滴管状，用其加入无水乙醇，有一个公共的滴管，每个样品一
17、个，千万不要将样品弄混，蒸发的过程会出现一圈圈的杂质，边蒸发边使其进入液体中（有糖）。尽量使蒸发的体积控制在最小，这样赶酸会比较快。PH达到中性偏酸后，用无水乙醇将对应的水解管冲几遍，将样品转移至水解管中，向蒸发皿中加入无水乙醇，冲几次，浓缩一下，不要使其体积过大，水解管装不下，体积大概控制在水解管的四分之三处。1.6.5 真空泵抽干将1ml枪头从下面切开，装在真空泵的胶管上，打开真空泵，将枪头慢慢靠近水解管，利用空气的力量将无水乙醇带走，但千万不要吸走液体，否则糖就没了，等到液面下降到很低时，可旋转着使液体挂壁，更快吹干，直至液体吹干，管壁上挂满糖，如果有乙醇存在，将检测不出来。虽然管里没有
18、液体了，但是还要再吹一会儿，尽量使其充分干燥。1.6.6 除盐 刷黑盖小瓶（除盐用），烘干。（将烘箱调至30）配制0.1mol/L碳酸钠。0.159g无水碳酸钠+15ml蒸馏水，混匀，每只水解管1ml取称量纸，称取1mg肌醇（非常少），作为内标一定要称准，将称量纸的对角折起，弹入水解管，挂壁的肌醇冲下去。30烘箱，处理50min。每只水解管加入50mgKHB4，因为KHB4需避光，需快速称取，用过后KHB4一定要封上。室温放置1.5h。（烘干蒸发皿，配制25%乙酸：5ml无水乙酸+15ml蒸馏水）。转移至黑盖小瓶中，标号。因为要避免糖损失，用200l的枪吸至小瓶中，将水解管倾斜，然后吸25%乙
19、酸到水解管中，轻轻打入，用刚才的枪头再次转移至小瓶中，滴加，反应非常剧烈，大量气泡产生，而且飞到瓶壁上，加乙酸时有意识地冲一下。Ph=6。用小勺加事先处理好的阳离子交换树脂，稍高于液面就行，除盐2h。（将水解管用蒸馏水冲干净，待用；漏斗洗干净，过滤用）做一个滤器，用蒸馏水润湿。用小勺将树脂盛入滤器中，用蒸馏水将小瓶中残留的糖洗干净，体积控制在78ml左右，待不再有液体滴出时，再用2ml蒸馏水冲一下，滤至蒸发皿中（标号），过滤后，树脂再放回小管中，以免树脂上有残留的糖。1.6.7 赶酸：用甲醇赶酸，7080水浴，蒸馏水蒸发的差不多时，再滴入甲醇，勿弄到手上，至PH至中性。用自制滴管吸至水解管中（
20、水解管洗干净，烘干），几次冲洗，用滴管沿壁冲洗，使劲刮，以免糖损失，几次冲洗的吸至水解管中。1.6.8 真空抽干将盖子拧开，盖上保鲜膜，用枪头扎眼，调真空干燥器至85，升至后，放入。真空泵使用方法：抽气打开，底下的钮拧至开，插电源（泵有声音），待负压指示不动时，将底下的钮关上，拔电源，干燥器里为负压环境，看表。大概2h后，抽干，如果未干，适当延长时间。打开放气，得一会干燥器的盖子才能打开，摘下保鲜膜，1ml正丙胺，1ml无水吡啶，拧紧，55，30min。抽真空（干后白色糖）0.5ml无水吡啶，0.5ml乙酸酐，晃几下，拧紧，划线，901h，变黄色。真空泵抽干。1ml无水二氯乙烷，使糖溶解，壁上
21、的要弄下来。转移至1.5ml离心管中，盖紧，4000rpm，10min（标号）。将上清转移至新的离心管中，盖紧盖子，用封口膜封上。1.6.9色谱分析2结果通过正交法得出提取优化多糖的最佳实验条件：试验样品香菇的原质量为，提取的粗糖干燥后的质量为，回收率。用苯酚硫酸法测定单寡糖与多糖的含量。标准曲线的制定试管编号012345标准液量/ml0OD值0根据测定的OD值绘出标准曲线测定的待测样的OD值为、，平均值为。带入公式中求出待测样中糖含量为用薄层层析分析法和纸层析法分析多糖的单糖的组成薄层层析图片从照片中可以看出组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖，待测样的层析结果模糊不清楚，是因为点样少，糖含
22、量少。纸层析结果纸层析结果不如薄层层析清楚，结果相同，样品中组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖。2.4 Sepharose CL-6B柱层析法分析多糖相对分子质量分布标准样品的测定蓝葡聚糖40管重铬酸钾93管前10管体积柱高2ml/管样品分子量万洗脱体积2mL/管吸光490nm柱高管号4585960616263洗脱体积（mL）82114116118120122124126吸光值（OD）管号6465666768697075808590洗脱体积(mL)12860170180吸光值（OD）（图一）样品分子量万洗脱体积2mL/管吸光490nm柱高管号404550557洗脱体积（mL）841114吸光
23、值（OD）管号5859690洗脱体积（mL）116118120170180吸光值（OD）（图二）lgMrVe/mL110120（图三）待测样的结果样品分子量样品洗脱体积2mL/管吸光490nm柱高管号345464748505595洗脱体积（mL）6910190吸光值管号675767778808590洗脱体积（mL）1261486160170180吸光值（OD）（图四）洗脱体积为150ml，对应标准曲线2.5 气相色谱分析结果香菇多糖中的单糖种类及相对含量（内标肌醇出峰时间为11.123）糖类标准品相对保留时间样品的相对保留时间单糖种类相对峰面积（）1岩藻糖2阿拉伯糖3木糖4半乳糖5葡萄糖香菇多
24、糖的色谱分析2、讨论通过正交法得到最佳提取多糖方案，本实验中没有进行正交试验，直接用最佳方案提取得到粗多糖，计算得到的回收率为。回收率较其他组大很多，最可能的原因就是用乙醇、乙醚脱水不充分，干燥后粗多糖中含有水分；数值大的另一个原因是在煮香菇的过程中，提取滤液时进行挤压，滤液提取较其他组更充分。用苯酚-硫酸法测定单寡糖与多糖的含量，测得含量为，说明提取的粗多糖中糖含量约为，其中有很大一部分为杂质。我们在对提取的多糖进行组成分析，对提取的多糖样品用浓硫酸进行水解，水解成单糖，再用薄层层析和纸层析法判断单糖的组成。实验结果为组成多糖的单糖最有可能是葡萄糖和阿拉伯糖，也可能还有其他单糖成分。从实验结
25、果我们可以比较出薄层层析较纸层析分离效果好，更清晰，更易观察。我们又对提取的粗多糖进行定量分析，用Sepharose CL-6B柱层析法分析多糖相对分子质量的分布。根据提供的标准糖样品的相对分子质量和其洗脱体积画出标准曲线，以洗脱体积为横坐标，标准糖样品的相对分子质量的对数值为纵坐标，并求出标准曲线的函数，如图三。再测出待测样品的洗脱体积即可根据函数求出其相对分子质量，约为。即提取的粗多糖的相对分子质量在左右分布。气相色谱分析多糖组成中，可以测出香菇多糖中的单糖种类有岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖，其中含量最多的是半乳糖和葡萄糖。在香菇多糖中可能还有其他的成分，但含量较少。3、展望香菇
26、作为我们日常生活中的常见食材，具有很重要的药用价值和保健功能。其中发挥药用价值的成分即是本次试验中提取的多糖。目前许多国家科研单位和企业已经意识到在食材和药材中提取提纯药用多糖的重要性，药用多糖不仅为企业提供了商机，也对医疗保健、临床用药开辟了另一条途径。香菇多糖中抗病毒、抗肿瘤的药用价值已经受到了关注，并有了很好的应用。提纯多糖的仪器和方法也在不断改进，植物和真菌多糖的应用也会不断扩宽。参考文献【1】半夜马尾藻多糖的提取和分析孟庆勇, 刘志辉, 徐美奕, 东野广智，pp1560-1562December，2004【2】真姬菇子实体多糖的提取工艺优化李顺峰，刘兴华，张丽华，付娟妮农业工程学报第
27、24卷第2期2008年2月【3】粗江蓠多糖的提取及光谱分析孟庆勇，王亚飞，揭新明，东野广智，张立坚，pp1903-1906December，2006【4】贵州产天冬中多糖的提取及其抗氧化活性的研究李艳菊，李琴山，田硕，刘洋湖北农业科学第5l卷第7期2012年4月【5】香菇多糖的提取及其抗氧化性和保湿性评价王玢，任清，李奇，董银卯，赵云云 EDmLE FUNGI 2008（5）【6】香菇多糖的提取和纯化的研究屈永年，曾凡龙,高海涛,余志玲数理医药学杂志 2003年第16卷第6期【7】香菇多糖的提取和分离纯化及结构分析研究进展范晓良颜继忠阮伟峰 Strait Pharmaceutical Journal Vol 4 No.5 2012【8】茶叶多糖的分离纯化及分析邓俊林，许平，王志勇重庆师范学院学报(自然科学版)第15 卷第2 期【9】香菇多糖的成分及其分子量研究张俐娜，张平义，李翔，潘苏高等学校化学学报 NO9 15131517
