1、丙戊酸代谢酶中CYP2C9UGT1A6的基因多态性分析方法的建立丙戊酸代谢酶中CYP2C9、UGT1A6的基因多态性分析方法的建立(作者： 单位： 邮编： )作者：何周康，赵昕，阳利龙，张志华【摘要】 目的：研究药物代谢酶基因多态性对丙戊酸钠代谢的影响， 并建立分析丙戊酸代谢酶中 CYP2C9 UGT1A6勺基因多态性的方法。 方法：从人全血中抽取gDNA设计引物扩增CYP2C及 UGT1A6并运 用限制性片段长度多态性( RFLP)技术的方法进行 CYP2C9*2CYP2C9*3 CYP2C9*4 CYP2C9*5 UGT1A6*2和 UGT1A6*3勺分型。结 果：成功设计了引物用来扩增包
2、含 CY P2C9*3 CY P2C9*4 CY P2C9*5的片断，并测序验证。结论：建立了简单可靠的 RFLP基因分型方法。【关键词】 丙戊酸钠；药物代谢酶；基因；多态性Abstract Objective: order to study the effect of drug metabolizi ng en zymes (DME) polymorphism on the metabolism of valproic acid (VPA), we set up a method to analyze the DMEgene polymorphism. Methods:The GDNA/er
3、e extracted from blood of human. The CYP2CSbnd UGT1A6jene were amplified withPCR.Weused the restriction fragment length polymorphism (RFLP) to classify the CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*4, CYP2C9*5, UGT1A6*2 and UGT1A6*3 gen otypes. Results:A successful design of the primers was used to contain expa ns
4、ion of CY P2C9 * 3,CYP2C9* 4, CYP2C9* 5 of the clips, and sequencing and verification were performed.Conclusions:We established asimple and reliable RFLPmethod to group the UGT1A6&nd CYP2C9.Key words Valproic acid; Drug metabolizing enzymes; Gene;Polymorphism丙戊酸钠（VPA是治疗儿童癫痫的常用药物，有效治疗浓度为50 100卩g/mL,但
5、个体差异很大，服用相同的剂量后进行血药浓度监测， 可以发现许多患儿的血药浓度低于 50卩g/mL或高于100卩g/mL。VPA对消化系统、肝脏及血液系统均有潜在的毒性，甚至出现致死性 肝坏死（多见于两岁以下儿童），严重影响VPA的临床应用。因此， 为指导临床合理用药，减少不良反应，需了解VPA的药代动力学特点， 进行个体化治疗。VPA在体内97%通过肝脏代谢，其中50%通过尿苷酸二磷酸葡萄糖 醛酸酶（UGT代谢（UGT1A6 UGT1A9 UGT2B7, 40%通过线粒体B 氧化，而10%左右通过细胞色素P450代谢1, 4,国外已有在体 外运用肝微粒体孵育的方法对丙戊酸钠的代谢进行研究 4,
6、但是目前国内还很少有关于 UGT基因多态性对丙戊酸钠代谢影响的体内体 外研究。国外在体外的肝微粒体孵育试验中证明， VPA具有肝毒性的代谢产物为4以ene以VPA这种产物主要由CYP2C9代谢产生5。而目前发现的几种 CYP2C基因突变中6, 7, CYP2C9*1 CYP2C9*2CYP2C9*3代谢生成4 ene VPA的水平有很大差异。因此，在体外 体内研究CYP2C9基因多态性与肝毒性代谢产物的生成差异，有重要 的临床意义。目前，有关 UGT1A6 UGT1A9 UGT2B7 CYP2C9 CYP2C19的基因多 态性研究发现这些代谢酶存在许多单核苷酸突变位点（ SNPS ,而且其中很
7、多突变影响了其代谢药物的能力 8 12。我们希望通过我们的实验研究，建立一种快速、可靠、简便的基因分型方法，对这几种 药物代谢酶进行基因分型，以指导临床个体化用药，做到用药合理安 全。1材料与方法1.1材料1.1.1实验仪器PB303 N电子精密天平梅特勒.托利多仪器（上 海）有限公司;Thermo Hybaid Px 2 梯度 PCR仪（ThermoHybaid， USA； DY Y以6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；自动电泳凝胶成像 分析系统GDS 8000（ UVP USA ；小型高速离心机 D 37520（Sigma, USA； 420三用恒温水箱。1.1.2 分子生物制剂 引物（上海
8、英骏生物有限公司）;DNA胶回收 试剂盒（Omega USA； TaKaRaLA Taq 酶及 r Taq 酶；Gen eRuler 100 bp DNA Ladder Plus （Fermentas）；内切酶（NEB;其它试剂皆为国 产分析纯。1.1.3 人全血标本 用一次性注射器，晨8点餐前采患者上臂静脉血5 mL置于EDTA抗凝管中，-20 C放置待进行基因组 DNA提取。1.2实验方法1.2.1人血GDNA提取方法13 采用TKM血液DNA提取法。取2 mL含抗凝剂的全血加入 2 mL已配制好的缓冲溶液1（ 10 mmolTris HCI pH 7.4 , 10 mmolKCl, 10
9、 mmolMgCI2, 2 mmolEDTA）和50卩L NPL40,旋涡振荡器上充分混匀，3 000 r/min 室温离心10 min,弃上清液，细胞沉淀中再加缓冲溶液I,混匀后再离心，如此 反复35次直至上清液由红色变为无色。在含白细胞沉淀的试管中 加入0.32 mL溶液H （溶液I中加0.4 mol NaCl）,将白细胞再悬浮， 然后加入50卩L10% SDS和0.30 mL饱和NaCl混匀，室温下轻摇 过夜后，12 000 r/min 离心10 min，取上清加等量异丙醇或3倍体 积的乙醇，摇匀，置-20 C 1 h以上沉淀 DNA 13 000 r/min 离心 25 min,弃上清
10、，再用80%勺乙醇洗涤，同上离心10 min, DNA沉淀 风干后溶于50卩L消毒重蒸水中。1.2.2引物设计根据Pubmec上获取的CYP2C9基因全序列（NM000771,设计所关注 的 CYP2C9*2 CYP2C9*3 CYP2C9*4和 CYP2C9*5的 弓 I物，弓 I物设计及 酶切位点设计参考文献方法。因为 CY P2C9* 3 CY P2C9*4 CY P2C9*5同在一个外显子上且比较靠近，故选用同一引物。引物序列及其各个 位点内切酶见表1。表1 CY P2C9引物序列及文献报道突变频率根据 Pubmed上获取的UGT1A6勺基因全序列（NM001072，设计所关注的 UG
11、T1A6*2和 UGT1A6*3的引物，引物设计及酶切位点设计参照文献3,8。因为UGT1A6*呼口 UGT1A6*3同在一个外显子上，故选用同一引物。 引物序列及其各个位点内切酶见表 2。表2 UGT1A6引物序列及文献 报道突变频率1.2.3PCR反应体系、循环条件及酶切条件(1)C YP2C9CY P2C9*2PCR的反应体系包括：10 mM Tris HCI (pH 8.3) ，50 mmol KCI，1.5 mmolMgCI2, 200 mmoldNTP 200 nmol primers，50 ng/mL BSA 100 ng 的 genomic DNA禾口 1 unit Taq 。
12、PCR的循环条件为：94C5 min94C30 s61C45 s72C1 min 35 cycles72C5 minPCR产物片断酶切条件：Ava II 37 C,水浴4 h。CYP2C9*3 CYP2C9*4 CYP2C9*5PCR的反应体系(25卩L体系)包括：12.5卩L buffer , PCRrimers(10 pmol) , 8.5 L H2O, 1.5 unit Taq 酶和 40 ng 的 DNAPCR的循环条件为：95 C 15 min 94 C 30s55 C 30 s72 C 45 s 40 cycles72 C 7 min因3个位点较近，酶切后未找到较好方法进行分辨，故
13、采用测序。(2)UGT1A6UGT1A6*2 UGT1A6*3PCR的反应体系同上。PCR的循环条件为：95 C 4 min95 C 30s64 C 1 min72 C 1 min 35 cycles72 C 7 minNsi I 酶切T181A突变，Fnu4H I 酶切R184S突变。PCR产物片断酶切条件：37 C水浴3 h。2 结果2.1 CY P2C9CY P2C9*2PCR的产物为261 bp,经Ava H酶切，并用3%琼脂糖胶电泳后，R144 C突变时，突变纯合子不被酶切为 261 bp的单条带，野生型纯合子 被酶切为223 bp和38 bp的两个条带，杂合子为 261 bp、22
14、3 bp、 38 bp三条带，见图1。2.2 UGT1A6PCR的产物为992 bp，分别经Nsi I、Fnu4H I酶切，并用3癥 脂糖胶电泳后，T181A突变时，突变纯合子被酶切成616 bp和376 bp 两个片断，野生型纯合子为992 bp 一条带，杂合子为992 bp、616 bp、 376 bp三条带，而R184S突变时，突变纯合子被酶切成 464 bp、369 bp和159 bp三个片断，野生型纯合子为 833 bp和159 bp两条带， 杂合子为833 bp、464 bp、369 bp和159 bp四条带。3讨论由于目前认为在丙戊酸钠的 UGT代谢中，UGT1A6起主要作用，而
15、 CY P2C9基因多态性与丙戊酸钠肝毒性产物的产生具有密切关系，所 以我们首先选择这两个位点进行研究。目前CYP2C9共发现并证实有13个SNPs而目前的研究热点集中在CYP2C9*2 14和 CYP2C9*3: 15。CYP2C9*4目前只在亚洲人有发 现，而在白种人、非洲裔美国人并无发现，突变频率为 0.02 : 16。CYP2C9*5和 CYP2C9*6在非洲裔美国人发现，突变频率为0.017 : 17 和0.006 : 18。Blasidell 等通过CYP2C9*12发现了变异体并命名为 CYP2C9*7其频率在非洲人群中从 0.006至U 0.03。CYP2C9*8CYP2C9*
16、11和CYP2C9*12目前已经实验证明，与野生型 CYP2C9*1相 比，在体外会改变其代谢活性19。CYP2C9*13是在中国人群中发 现，突变频率为0.01 ,并认为能够减低CYP2C的活性20。CYP2C9 引起氨基酸改变的SNPs均可影响其酶的代谢活性，而其中研究较明 确的为CYP2C9*2和 CYP2C9*3它们都可以引起酶活性的显著减低。而研究6, 7发现 CYP2C9*2和CYP2C9*3对代谢 VPA以及生成4 ene； VPA的能力有很大区别，这与肝毒性有着直接的关系，因此 对CYP2C的分型就显得尤为重要。我们的研究结合以往的CYP2C的 基因分型的方法，建立了一个简单经
17、济的分析 CY P2C9*2的限制性片段长度多态性(RFLP技术的方法，并成功设计了引物用来扩增包含 CYP2C9*3 CYP2C9*4 CYP2C9*5勺片断，并测序验证。目前UGT1A6发现了 13个SNPs其中包括6个新发现的突变。 UGT1A6*2 UGT1A6*3研究得较为明确，但认为其对药物代谢活性的 影响，突变纯合子与杂合子有很大区别或产生完全不同的影响。 因此对临床应用VPA的患者进行UGT1A分型也非常重要，这样可以达到 控制有效药物浓度，提高疗效，避免不良反应的目的。我们建立了简 单易行的RFLP方法，期望验证后对指导临床用药有所帮助。如何设计出CYP2C9*3 CYP2C
18、9*4 CYP2C9*5简便的酶切方法，争取一次抽血便可对4个SNPs进行分型，以及进一步对 UGT1A9 UGT2B7 进行研究，以探明VPA代谢酶基因突变程度与 VPA血药浓度、中间代 谢产物数量的相互关系，是今后的研究方向，这样才能更好地指导临 床合理应用VPA避免药物不良反应的发生。【参考文献】1 Ketter TA,Frye MA,Cor a 沢 Locatelli G,et al. Metabolism and excretion of mood stabilizers and newanticonvulsants J . Cell Mol Neurobiol, 1999, 19
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