1、,1,第四章 卫生微生物研究和检测的方法,2,卫生微生物检测的特点及基本原则卫生指示微生物 卫生微生物研究和检测的方法 卫生微生物研究和检测方法的前景,3,第一节,卫生微生物检测的特点及基本原则,4,1.卫生微生物检验与医学微生物检验的区别与特点?2.样品的采集原则？3.影响采样代表性的因素有哪些？4.怎样使采样具有针对性？5.样品采集后为什么要尽快送检？6.怎样保护样品中的待检微生物？7.样品中抑菌物质 去除方法有哪些？8.样品的处理策略（目的）与方法9.怎样浓缩样品中的微生物？10.环境中的微生物数量低，怎样提高检出率？,5,卫生微生物检测的特点,1检测的对象多病原微生物+非致病和条件致病
2、微生物特别是能反映环境、食品、健康相关产品等样品卫生质量的卫生指示微生物。,6,2检测的范围广，标本的来源不仅局限于人体，也来源于空气、水、食品等环境。,7,3检测的方法更敏感，以检测环境标本中数量很低的致病微生物。问题：你知道哪些方法？你认为什么方法更敏感？,8,4定量测定和分型检测，以探明感染性疾病的传染源、传播途径、流行情况等。,9,卫生微生物检测的基本原则,采集、保存、运送、检测,10,总原则,生物安全代表性/针对性防污染防杀菌细标记,11,生物安全,防人员感染：个人防护（？）防标本和环境的污染：无菌操作、恰当处理污染废弃物,裴晓方,12,注意采样的代表性,影响采样代表性的因素包括:采
3、样量采样部位采样时间采样的随机性和均匀性以及按批号抽样,13,注意采样的针对性,样品种类恰当时间采样量,14,避免采样时外界微生物对样品的新污染：所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。,15,避免采样时对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质：如容器是否有消毒剂的残留，或使用刚烧灼未冷却的采样工具。,裴晓方,16,注意对样品的详细标记：样品名称编号采样时间采样者检测项目,2023/5/18,裴晓方,17,样品的运送原则,尽快送检采集的样品，应在规定的时间内（一般不超过34小时）送到实验室，尽快送检。一方面可减少待测微生物的死亡。另一方面可防止微生物的繁殖对计数结果的影响,2023/5/1
4、8,裴晓方,18,保护待检微生物,温度调节加入保护剂去除其他不利于待测微生物生存的因素,2023/5/18,裴晓方,19,pH蛋白质抑制剂抑制非目的微生物渗透压气体,2023/5/18,裴晓方,20,遵循完善的样品交接制度,送往实验室的样品，必须附有样品送检单，实验室收到样品应按送检单逐项核对，检查样品是否符合检验要求，确证无误方可签收待检。,2023/5/18,裴晓方,21,实验室检验原则,2023/5/18,裴晓方,22,相应的硬件条件和设备具有合格的检验人员标准/公认的检验方法实验室质量控制,环境,实验室环境不应影响检验结果的准确性工作区与办公区分开工作面积应满足检验工作的需要温度、湿度
5、、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求整体布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染一般样品检验：洁净区（超净工作台或洁净实验室）病原微生物分离鉴定：BSL-2,2023/5/18,裴晓方,24,应有检测不同病原菌的相应的条件和设备微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等可分成不同的危害等级。在不同生物安全级别实验室进行,2023/5/18,裴晓方,25,实验室生物安全与管理 很重视?,2023/5/18,裴晓方,26,病毒灭活不彻底引发实验室感染,2004北京、安徽发生非典疫情原因调查结果。调查组认为，本起疫情来自中国疾控制中
6、心实验室内感染，而引起实验室感染的环节，是腹泻病毒室工作人员进行实验时，对SARS病毒灭活不彻底。,2023/5/18,裴晓方,27,实验室生物安全与管理,生物危害非工作人员严禁入内,2023/5/18,裴晓方,28,实验室生物危害,在微生物和生物医学实验室研究过程中生物因子（病原微生物）对人、环境、生态和社会造成的危害和污染。,2023/5/18,裴晓方,29,实验室生物安全,为了避免微生物和医学实验室中在进行各种有危害或有潜在危害的生物因子活动过程中，可能对人、环境和社会造成的危害或潜在危害，而采取的防护措施（硬件）和管理措施（软件），达到对人、环境和社会的安全防护目的,2023/5/18
7、,裴晓方,30,微生物实验室生物安全,主要考虑实验室生物安全防护，即实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时，通过在实验室设计建造、使用个体防护设施、严格遵从标准化的工作及操作程序和规程等方面采取综合措施，确保实验室工作人员不受实验对象的感染，确保周围环境不受实验对象的污染。,2023/5/18,裴晓方,31,实验室生物安全级别,2023/5/18,裴晓方,32,感染性微生物的危险度等级分类,危害等级I(低个体危害，低群体危害)不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。危害等级(中等个体危害，有限群体危害)能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群
8、体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。,2023/5/18,裴晓方,33,感染性微生物的危险度等级分类,危害等级III(高个体危害，低群体危害)能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。危害等级(高个体危害，高群体危害)能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。,2023/5/18,裴晓方,34,实验室可以分为,基础实验室 一级生物安全水平（BSL-1)基
9、础实验室 二级生物安全水平（BSL-2)防护实验室 三级生物安全水平（BSL-3)最高防护实验室 四级生物安全水平（BSL-4)根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平。,2023/5/18,裴晓方,35,传染病分类传染病防治法,甲类传染病是指：鼠疫、霍乱。（2）乙类传染病是指：传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋
10、病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾。（25）,2023/5/18,裴晓方,36,传染病分类 传染病防治法,丙类传染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病、手足口病。（11）对乙类传染病中传染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感，采取本法所称甲类传染病的预防、控制措施。,2023/5/18,裴晓方,37,传染病分类,根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类：第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾
11、病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。,病原微生物实验室生物安全管理条例,2023/5/18,裴晓方,38,传染病分类,第三类病原微生物，是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。第四类病原微生物，是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。,病原微生物实验室生物安全管理条例,人员-食品微生物检
12、验,具有微生物专业背景和相应资质掌握生物安全知识和消毒知识，能够理解并正确实施检验（防止人为污染样品、保护环境、自身安全）颜色视觉障碍 涉及到辨色的实验,2023/5/18,裴晓方,40,具有合格的检验人员必须经常接受专业技术培训，掌握检验项目的基本原理及技术方法 技术质量考核：可用几种基本技术作考核评价的指标。细菌计数：可使用分散性和稳定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢悬液。请几名被试人员用直径9cm10cm的普通营养琼脂平板，作表面涂沫接种计数，重复作5次，求平均数和标准差，以标准差小，和显微镜直接计数折算值接近的为佳。生化试验重现性：用铜绿色假单胞菌CMCC（B）1012株
13、，。模拟样品检出考核：选合适的基质如奶粉，加入指标菌，如普通变形杆菌CMCC（B）49001株。考核前先作预备试验。指定检验方法，确定检出最小菌数。然后用最小菌数的5倍量、10倍量加入模拟基质中，进行检出试验，从盲检结果的正误进行评定。,2023/5/18,裴晓方,41,采用标准/公认的检验方法进行检测,凡有国家标准、部颁标准或行业检查方法的均按标准方法检验。没有国家或部颁标准，按上级疾病预防控制中心的要求，参照共同协定的方法检验,2023/5/18,裴晓方,42,加强实验室质量控制,仪器设备的质控：培养基、试剂的质量控制：消毒灭菌效果的控制：建立良好的实验记录制度：建立良好的核查、校对制度
14、报告与核查制度,2023/5/18,裴晓方,43,根据卫生检验的特点采取特殊措施,做好应对突发事件的准备如果一个样品需做多种分析，检测微生物 优先样品处理：均质化、乳化后再行稀释；抑菌物质去除；目的菌浓缩(样品的处理策略（目的）与方法?)微生物的复苏,2023/5/18,裴晓方,44,避免微生物实验室感染,气溶胶避免微生物污染操作环境作好培养废弃物、用具和样品等的处理作好个人防护,2023/5/18,裴晓方,45,第二节,卫生指示微生物,2023/5/18,裴晓方,46,指示微生物indicator microorganism是在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（
15、或细菌）。,2023/5/18,裴晓方,47,分为四种类型,菌落总数（细菌、霉菌和酵母菌数）大肠菌群、粪链球菌、产气荚膜梭菌 其它指示菌：特定菌、某些致病菌病毒（包括噬菌体）,2023/5/18,裴晓方,48,选择指示微生物的总原则,数量大易于检出 检验方法简单、经济、方便 有一定的代表性，其数量变化能反映样品卫生状况及安全性,2023/5/18,裴晓方,49,卫生微生物检验中最重要的指示微生物,大肠菌群指示粪便污染,2023/5/18,裴晓方,50,作为粪便污染指示菌的条件有哪些？,大量存在于人及温血动物肠道，未被粪便污染的样品中无此种菌存在；在外环境中的抵抗力，包括对消毒剂的抵抗力与肠道致
16、病菌大致相似或稍强；在外环境中不繁殖，存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长；检验方法简便，易于定量计数。,2023/5/18,裴晓方,51,为什么常常通过检测指示微生物反映样品卫生安全性？,2023/5/18,裴晓方,52,与人类健康密切的样品，如直接进口的食品、饮用水，除检测卫生指示微生物外，还要求直接检测某些致病菌如：沙门菌志贺菌金黄色葡萄球菌,2023/5/18,裴晓方,53,常用的指示微生物,2023/5/18,裴晓方,54,菌落总数Aerobic Plate Count,概念：菌落总数是指被检样品的单位重量(g)、容积(ml)、表面积(cm2)或体积(m3)内，所含有的能在某种培养基上
17、经一定条件、一定时间培养后长出的菌落数量。以菌落形成单位数（colony forming unit，cfu）表示。,2023/5/18,裴晓方,55,种类：菌落总数包括细菌菌落总数、霉菌菌落总数和酵母菌菌落总数。卫生学意义：用于判定检样被微生物污染的程度或动态观察，也是某些样品的卫生限量标准。测定方法：常用标准平板计数法(standard plate-counting method)和表面涂布法（Spatula Method）,2023/5/18,裴晓方,56,标准平板计数法(standard plate-counting method),又称为倾注平板计数法At what temperatu
18、re should pour plates be dispensed?Desired temperature is 45 1C.,生长在固体培养基上，来源于一个?细胞，肉眼可见的细胞群体。,2023/5/18,裴晓方,58,菌落计算方法（1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。,（2）菌落计数的报告平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度
19、的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。,稀释度的选择 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平
20、均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。,2023/5/18,裴晓方,64,表面涂布法（Spatula Method）,倾注平板计数法,表面涂布法,2023/5/18,裴晓方,65,2023/5/18,裴晓方,66,粪便污染指示菌,大肠菌
21、群（coliform group）：是一群能在3537C、24小时内发酵乳糖产酸产气的、需氧或兼性厌氧的、革兰阴性的无芽胞杆菌。是存在于人和温血动物肠道中的一大群菌。,2023/5/18,裴晓方,67,主要包括：四个属的菌埃希氏菌属(Escherichae)克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)枸橼酸杆菌属（Citrobacter）,2023/5/18,裴晓方,68,根据生长温度的差异，将能在37C生长的称为总大肠菌群，而在44.5C仍能生长的大肠菌群称为耐热大肠菌群(thermo-tolerant coliform group)或粪大肠菌群（faecal c
22、oliform Fc），耐热大肠菌群的主要成员是埃希氏菌属的菌。,2023/5/18,裴晓方,69,大肠杆菌（Escherichae coli）：,普遍存在于人和动物的肠道内（新鲜粪便中每克可达109 CFU），近年来随着测定新方法的发现和建立，大肠杆菌作为粪便污染的指示菌的应用越来越多。利用大肠杆菌产生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，产生有色物质，而使大肠杆菌菌落显色，对大肠杆菌数进行测定。,2023/5/18,裴晓方,70,作为粪便污染的指示菌，大肠杆菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。,GB/T 4789.3-2008大肠菌群MPN计数,初发酵,复发酵
23、,大肠菌群月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤发酵结果,初发酵,阳性,阳性,阳性,阴性,复发酵,煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤,接种,样本,阴性,阳性,大肠菌群煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤发酵结果,08版大肠菌群MPN计数较03版的优势有：,08版操作更简单，适合批量检测 08版检出的概率大 乳糖发酵培养基基本上不具备修复已损伤的细胞的作用，而月桂基硫酸盐胰蛋白胨则可以。08版减少了人为的误差 03版需要挑选菌落，受人主观的影响很大，没有挑对或挑取的不够多都会导致假阴性结果，而08版采取增菌液接种，会减少假阴性。,GB/T 4789.3-2008新增大肠菌群平板计数,平板计数,证实试验,典型菌落：
24、紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大,大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）上的生长情况,GB/T 4789.3-2008新增大肠菌群PetrifilmTM测试片法,准备PetrifilmTM测试片,接种1ml样本液,缓慢盖上上层膜,用压板轻压培养基,样本接种结果,红色有气泡的菌落确认为大肠菌群,大肠杆菌MPN计数,初发酵,复发酵,伊红美蓝平板分离培养,营养琼脂斜面或平板培养,生化试验,大肠杆菌VRB-MUG平板计数法,检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照,大肠杆菌PetrifilmTM测试
25、片计数法,与大肠菌群PetrifilmTM测试片计数法方法一致结果判读大肠杆菌 大肠菌群,蓝色带气泡的菌落,红色带气泡的菌落,2023/5/18,裴晓方,82,粪链球菌（fecal Strptococcus Fs）,2023/5/18,裴晓方,83,产气荚膜梭菌（Clostirdia）,是一类能还原亚硫酸盐为硫化物、厌氧生长的、革兰阳性梭状芽胞杆菌。是人和动物，特别是食草动物肠道内的常住菌，数量少于大肠杆菌，每克粪便约为105106。由于该菌能形成芽孢，对含氯消毒剂及外界不良环境有较强的抵抗力，在外环境中存活时间较长。所以若样品中产气荚膜梭菌被大量检出而大肠菌群数量很少时，则表示样品曾受过粪便
26、污染，即有陈旧性污染。常被作为水或土壤卫生细菌学检验中的指标菌。,2023/5/18,裴晓方,84,其它指示微生物,（1）不得检出的致病菌（2）肠道病毒的指标微生物 1）大肠杆菌噬菌体f2(coli phage)2）脊髓灰质炎病毒(polio virus)减毒疫苗株I,2023/5/18,裴晓方,85,第三节卫生微生物研究和检测的方法,2023/5/18,裴晓方,86,卫生微生物样品特点：目的菌数量低细菌受损杂菌多,数量低浓缩细菌受损复苏杂菌多选择性增菌和分离,2023/5/18,裴晓方,87,（一）样品处理,1样品混匀：2样品浓缩：,2023/5/18,裴晓方,88,（一）样品处理,1样品混
27、匀：液体样品常通过电动、手摇或敲打震荡，使之混匀；固体样品需通过置灭菌乳钵内研磨均匀，或于高速组织捣碎机或匀浆器中在少量液体存在下，捣碎混匀后再取样，或使用商品化的均质器混合待检样品。,2023/5/18,裴晓方,89,2样品浓缩：,常用的样品浓缩方式有沉淀法过滤法吸附法,2023/5/18,裴晓方,90,（1）沉淀法：细菌可通过普通离心机离心沉淀而浓缩，或者通过差速离心，去除杂质，收集菌体，达到浓缩的目的。病毒浓缩需采用高速或超速离心机。,2023/5/18,裴晓方,91,2023/5/18,裴晓方,92,2023/5/18,裴晓方,93,2023/5/18,裴晓方,94,（2）过滤法：是将
28、样品在负压或正压作用下，通过孔径为0.45m的滤膜，细菌被阻留在膜上，而达到浓缩的目的。样品中的病毒可通过膜的静电吸附浓缩。过滤法不但可浓缩微生物，还可消除样品中的抑制剂对后续培养的影响。,2023/5/18,裴晓方,95,2023/5/18,裴晓方,96,2023/5/18,裴晓方,97,2023/5/18,裴晓方,98,2023/5/18,裴晓方,99,2023/5/18,裴晓方,100,（3）吸附沉淀法：可分为特异性和非特异性吸附两类。非特异性吸附如利用加入化学制剂，形成沉淀，细菌被共沉淀的方法；而特异性吸附则是利用配体与受体的亲和力，吸附待检微生物，如为浓缩检样中的流感病毒，利用该病毒
29、具有血凝素，可与红细胞结合的特点，将检品中加入红细胞吸附病毒，低速离心收集红细胞，而达到浓缩病毒的目的。,2023/5/18,裴晓方,101,（二）损伤菌的复苏,环境样品中的微生物，因经受冷、热、脱水干燥、辐照、高渗透压或消毒剂的作用，可能引起亚致死性损伤，受损伤的微生物用一般的培养方法不易培养，需预先进行复苏（resuscitation）或修复（repair）后，才能进行常规的检测。修复的基本方法是在细菌繁殖之前，将其置于无选择性压力的培养环境中，一般降低培养温度培养一定时间后，再进行常规检验。,2023/5/18,裴晓方,102,（三）选择性增菌与分离,1物理方法：主要通过调节培养的温度、
30、气体条件和光照，进行选择性增菌与分离的方法。2化学方法：利用目的微生物的特定生理功能在分离培养基中加入抑制其他微生物生长和显示目的微生物的化学制剂，配制成选择性鉴别培养基，达到对目的微生物增菌分离的目的。学习后应能举例说明。,2023/5/18,裴晓方,103,（四）定量计数方法,1倾注平板计数法 2表面涂布计数法 3MPN法：即最可能数法(most probable number,MPN)4其它方法：包括显微镜直接计数法、比浊计数法、微菌落快速计数法、生化方法间接推算微生物量，以及半定量法（semi-quantitative method）等。,2023/5/18,裴晓方,104,分型鉴定的方法,噬菌体分型细菌素分型耐药谱分型血清学分型质粒图谱分型,2023/5/18,裴晓方,105,其他方法,微生物鉴定系统免疫核酸杂交PCRG+C含量基因芯片 蛋白质芯片,2023/5/18,裴晓方,106,第四节卫生微生物研究和检测方法的前景,
