1、分子生物学常用研究技术分子生物学实验指导第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则二、实验室安全防护 第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化二、聚合酶链反应技术三、分子杂交技术四、分子克隆技术五、其它新技术第三节、常用仪器使用一、离心机二、分光光度计三、PCR仪第四节、如何撰写实验报告第五节 核酸分离纯化技术实验一、基因组DNA的提取制备与检测实验二、总RNA的提取制备与检测实验三、质粒DNA的提取制备与检测第六节 PCR技术实验四、常规PCR技术实验五、定量PCR技术第七节 分子克隆技术实验六、DNA的限制性酶切与电泳实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收实验八、DNA连接实验实验九、感
2、受态细胞的制备实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选第八节 分子杂交技术实验十一、Southern 印迹杂交实验十二、Northern印迹杂交实验十三、Western印迹实验十四、核酸原位杂交第九节 综合性实验实验十五、蛋白质双向电泳实验十六、酵母双杂交实验实验十七、RNA干扰实验第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则1每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2实验前认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的，基本原理，操作步骤，懂得每一步操作的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。3实验时要听从指导老师的指导，严格认真地按规程进行实验，并注意与同组同学的
3、配合。未经许可，不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等。4实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上。实验结束时，实验记录必须送指导老师审阅后方可离开实验室；实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老师。5保持台面、地面、水槽内及室内整洁。精心爱护各种仪器，要随时保持仪器的清洁。如发生故障，应立即停止使用并报告指导老师。完成实验后应将器材洗净，把器材、药品归放回原处，试管倒置于试管架中并排列整齐。按规定处理好废物，废液，做好清洁卫生。器材、仪器如有损坏须立即报告指导老师并按学校规定进行适当比例赔偿。6按需要量取药品及蒸馏水等各种物品，注意节约。7公用仪器，药品用后放回原处。多取的药品不得
4、重新倒入原试剂瓶内。公用试剂瓶的瓶塞要随开随盖，不得混淆，更不能互相污染。严禁用口吸或用皮肤接触有毒药品与试剂。8需交指导老师保存的样品，药品及其他物品都应加盖，并标注自己的姓名，班级，日期及内容物。9废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。含强酸，碱及有毒废液应倒入废液缸。废纸屑及其它固体废物和带渣滓的废物倒入废品篓或废品缸中，不能倒入水槽或到处乱扔。书包及实验不需之物品放在规定处。10实验室内严禁吸烟！不得将含易燃溶剂的溶液近火。对电炉等火源，严格做到：人在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即拔去电炉插头和关好水龙头，拉下电闸。漏电的设备
5、一律不得使用。离开实验室前应该检查水、电、窗等是否关好。11实验室内一切物品，未经教师批准，严禁带出室外。12每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和其它服务性工作。二、实验室安全防护实验室是学校教学的重要科学基地，贮存有贵重的仪器和化学危险药品等。为防止损失和产生事故，必须做好防盗、防火、防水、防毒和安全用电等工作。 （一）防盗 1加强防卫，经常检查，堵塞漏洞。 2非工作人员不得进入仪器室，室内无人时随即关好门窗。 3仪器室内不会客，不住宿，未经领导同意，谢绝参观。 4发生盗窃案件时，保护好现场，及时向领导、治安部门报告。 （二）防火、防爆 1严禁在
6、仪器室内生火取暖。 2易燃、易爆的化学药品要妥善分开保管，应按药品的性能，分别做好贮藏工作，注意安全。 3做化学实验时要严格按照操作规程进行，谨防失火、爆炸等事故发生。 （三）防水 1实验室的上、下水道必须保持通畅。 2冬季做好水管的保暖和放空工作，要防止水管受冻爆裂酿成水患。 （四）防毒 1实验室必须做好防毒工作，有毒物质应妥善保管和贮藏，实验后的有毒残液要妥善处理。 2凡易燃、易毒、腐蚀剂等危险性药品要设专柜单独存放。要定期检查，严格管理，做到双人管理、双人收发、双人领取、双人记帐、双人把锁。 3实验中严格遵守操作规程，制作有毒气体要在通风橱内进行，保持实验室内通风良好。 4化学实验室备有
7、废液缸，实验室附近有废液处理池，防止有毒物质随意排放。 （五）安全用电 1实验室电路及用电设施要定期检修，保证安全，决不“带病”工作。 2如有电器失火，应立即切断电源，用沙子或灭火器扑灭。在未切断电源前，切忌用水或泡沫灭火机灭火。 3遇有人身触电事故，应立即切断电源，及时进入人工呼吸，急送医院救治。第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化核酸分子是分子生物学技术所涉及的主要对象，核酸分离纯化的质量好坏直接关系到后续实验的成败，所以核酸的分离提取是分子生物学研究中的一项重要的基本技术。核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的DNA包括染色体DNA与细
8、胞器DNA，前者位于核内，约占95，分子量大，是双链线性分子；后者位于线粒体或叶绿体，约占5，分子量较小，为双链环状分子。原核生物除了双链环状的染色体DNA外，还有双链环状的质粒DNA。在DNA病毒颗粒中，DNA的分子构型多种多样，有双链环状、双链线状、单链环状、单链线状等形式。在RNA病毒中，RNA的分子构型有双链线状和单链线状的差异。基因组DNA的总长度在不同的生物之间差异很大，一般随生物的进化程度而增大。与DNA相比，RNA要小的多，它的种类、大小和结构具有多样化，主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中，RNA以rRNA的数量最多（8085%），tRNA及
9、核内小分子RNA占10%15%，而mRNA分子大小不一，序列各异。DNA在碱性条件下相对稳定，而RNA在酸性条件下相对稳定，但强酸、强碱均可导致两者的变性与降解。DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的分离与纯化条件是不同的。分子生物学实验中最经常进行的是基因组DNA、质粒DNA以及细胞总RNA的分离提取。真核细胞基因组DNA分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒缠绕法等；质粒DNA分离提取的方法有碱裂解法、煮沸裂解法及SDS裂解法等。总RNA的提取方法主要是最常用的异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法。另外，近年来世界各大商业公司也纷纷投入巨资开发新的更为简便的核酸分离纯化试剂
10、盒，从而使核酸的分离纯化更为方便、快捷、高效和自动化。尽管核酸分离纯化的方法很多，但无论采取何种方法，其基本原则均为： 保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是进行核酸结构与功能研究的基本前提； 排除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度，以满足后续实验的要求。因此，核酸分离纯化的基本步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质，纯化核酸等。不同的核酸分离纯化方法分别具有不同的特点及适用范围，因此，在实际应用中，应根据具体生物材料、待提取的核酸分子的特点和研究目的对核酸完整性、纯度、产量的要求而选择不同的
11、方法。二、聚合酶链反应技术聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，应用这一技术可以将特定的微量靶DNA片断于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR技术的创立对于分子生物学的发展具有不可估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，极大的推动了分子生物学学科本身以及整个生物医学的发展。PCR技术当之无愧是生物医学领域中的一项革命性技术创举和里程碑。PCR技术由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K. Mullis等于
12、二十世纪八十年代中期发明创立，K. Mullis也因此贡献而获得了1993年度的诺贝尔化学奖。PCR技术的基本原理类似于DNA的体内复制过程，即以拟扩增的DNA分子为模板、以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片断为引物、以四种dNTP为原料、由DNA聚合酶按照半保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新的DNA，不断重复这一过程，即可使目的DNA分子得到扩增。PCR反应体系的基本成分包括有：模板DNA、引物、四种dNTP、耐热性DNA聚合酶以及含有 mg2+的缓冲液。PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸三个基本反应：模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双
13、链变性解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将反应体系的温度下降至适宜温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：与DNA模板结合的引物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的新链。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮反应的模板，经多次循环（25次40次），即可达到扩增DNA片断的目的。近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR技术本身也不断发展，操作也更为精细和自动化，如高保真PCR、热启动PCR、长距离
14、PCR、巢式PCR和梯度PCR技术的出现。同时，PCR技术也和已有其它分子生物学技术结合，进而形成多种PCR衍生技术。常见的PCR衍生技术有：1逆转录PCR，或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR），是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。即首先以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。该技术目前已经成为基因定性和定量分析的最常用技术之一。2原位PCR（in situ PCR），该技术是在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行
15、原位杂交，即可检测出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。该技术由Hasse等于1990年建立，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。3实时定量PCR（real time quantitative PCR）技术，该技术是在20世纪90年代末期发展起来的一种全新技术，它将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时检测PCR反
16、应进行的情况，因为反应管内的荧光信号强度到达设定阈值所经历的循环数（即Ct值）与扩增的起始模板量存在线性对数关系，所以可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和/或相对定量。而常规的PCR技术只能对PCR扩增的终产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应实时监测。作为一种新型的PCR技术，实时定量PCR技术不仅解决了传统PCR技术难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，并具有快速、灵敏度高和避免交叉污染等特点，已经广泛应用于基础研究中基因表达水平的分析和临床实践中基因诊断等领域。三、分子杂交技术分子杂交（molecular Hybridazytion）技术是目前生物
17、医学研究中最为常用的基本分子生物学技术之一。分子杂交技术最早可追溯至二十世纪六十年代Hall和Bolton等人的开拓性工作，但直到二十世纪七十年代，随着限制性内切酶、核酸自动合成的发展和应用，一系列成熟的分子杂交技术才得以建立完善和广泛应用。分子杂交技术可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，是一种最早建立的杂交类型，其主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难，同时误差较高且操作繁琐复杂，因此其应用较少。固相杂交是将参加反应的核酸等分子首先固定在硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等固体支持物上，然后再进行杂交反应，也
18、称为膜上印迹杂交。固相杂交后，未杂交的游离探针片段可容易地漂洗除去，同时还具有操作简便、重复性好等优点，故该法最为常用。固相杂交技术按照操作方法不同可分为：原位杂交（in situ hybridization）、印迹杂交（blotting hybridization）、斑点杂交（Dot blotting）和反向杂交等。其中原位杂交包括有菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等方法，印迹杂交则包括有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和Western印迹杂交等方法。菌落原位杂
19、交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此组织原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与
20、细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。Southern印迹杂交技术是由E.M Southern于1975年建立的，故称为Southern杂交。其基本原理和方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后变性处理后将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜等固相载体上，烘干固定后与标记的核酸探针进行杂交，最后通过放射自显影等方法显示杂交信号，从而可以确定被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。作为分子生物学的经典实验方法，该项技术已经被广泛应用于生
21、物医学基础研究、遗传病检测、DNA指纹分析等临床诊断工作中。继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，科学家们则将这种RNA印迹杂交方法趣称为Northern杂交，而后来的与此原理相似的蛋白质印迹杂交方法则也相应地趣称为Western杂交。与Southern杂交相似，Northern印迹杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后
22、进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。Northern杂交技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法，用于检测目的基因的表达水平和分子量大小。Western免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Bl
23、ot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。作为分子生物学的经典实验方法，该技术已经被广泛应用于检测蛋白水平的表达。斑点杂交是先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是耗时短，操作简
24、单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可做半定量分析，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂交的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。与上述的分子杂交技术不同，反向杂交则是用标记的样品核酸与未标记的固化探针DNA杂交，故称为“反向杂交”。这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中，可同时检测样品中几种核酸。这种杂交方式主要用于进行中的核酸转录试验和多种病原微生物的检测。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因
25、序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。四、分子克隆技术基因克隆（Gene cloning）是指在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入宿主细胞获得大量拷贝的过程，也称为DNA克隆、分子克隆或DNA重组技术。该技术建立的理论基础源于人们在对自然界基因转移和重组现象的认识。基因克隆技术的基本流程包括：获取目的基因；选择合适的载体并用相应的限制性内切酶切割目的基因和载体；用DNA连接酶连接酶切后的目的基因和载体，获得重组DNA分子；将重组DNA分子导入宿主细胞；筛选、鉴定出含有重组DNA分子的转化细胞；目的基因在宿主细胞中扩增和表达。基因克隆技术不仅是分子生物学实验中一项重要的基本技术，也
26、是基因工程的核心技术。对基因进行结构与功能研究，首先必须克隆相应的目的基因；另一方面，在基因工程中，要想获得某一基因的表达产物，也必须首先将目的基因克隆在一合适的表达载体中。该技术在疾病基因的发现、表达有药用价值的蛋白质、DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。五、其它新技术分子生物学是生命科学中发展最为迅速的一门基础学科之一，它的理论和技术也不断着其它生物医学学科的发展。分子生物学也是一门注重实验操作的学科，在其发展历史上，每一次重大理论的发现都离不开新技术、新方法的支撑。近年来，新的分子生物学技术不断涌现，层出不穷，并很快得到广泛应用。如最近发展起来
27、的RNA干扰（RNA interfering，RNAi）技术，RNA干扰现象于1998年发现，很快便被发展成为一个成熟的分子生物学研究技术广泛应用生物医学各个领域的研究，它不仅在基因功能的研究方面是一个强有力的研究工具，同时在基因治疗上也具有巨大的应用前景。另外，随着人类基因组计划（human genomic project，HGP）的完成，生物医学的研究也由此进入后基因组学时代，相应的一批在整个组学（-omics）水平上进行的全面、系统、大规模、高通量的系统生物学研究技术也得以建立完善和广泛应用，极大的促进推动了生物医学的研究。代表性的技术有：（1）在基因组学水平上，有对肿瘤组织细胞中的染色
28、体异常进行全面分析的基因组错配扫描（Genomic Mismatch Scanning，GMS）和比较基因组杂交（Comparative Genomic Hybridization，CGH）技术，以及对肿瘤表观遗传学进行系统分析的甲基化组学技术等。（2）在转录组学水平上，cDNA微阵列技术、消减抑制杂交（Subtractive Suppression Hybridization，SSH）和差示反转录PCR（Differential Display Reverse Transcription PCR，DD-RT-PCR）技术则可以对正常和肿瘤组织的mRNA表达水平进行全面的分析。（3）在蛋白质组
29、学水平上，以双向电泳和生物质谱技术为核心的蛋白组学研究技术可以对正常和肿瘤组织的基因表达水平在蛋白质水平上进行全面的分析。第三节、常用仪器使用一、离心机离心机的种类很多，根据转速不同，可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机。一般来说，转速少于6,000 rpm的为低速离心机，低于20,000 rpm的为高速离心机，超过20,000 rpm的是超速离心机；根据用途不同，还可以将离心机分为分析离心机和制备离心机。 一般实验室装备的离心机其最大转速约为4,000 rpm左右的台式或落地式离心机，现简要叙述一般离心机的使用方法。 1 将待离心的液体置于离心管中。 2 装有待离心液体的离心管分别放入
30、两个完整的并且配备了橡皮软垫的离心套管之中。置天平两侧配平，向较轻一侧离心套管内用滴管加水，直至平衡。 3 检查离心机内有无异物和无用的套管，并且运转平稳。将已配平的两个套管对称地放置于离心机的离心平台上。盖好上盖，开启电源。 4 调节定时旋纽于所需要的时间（分钟）。 5 慢慢转动转速调节旋纽，增加离心机的转速。当离心机的转速达到要求时， 记录离心时间。 6 达到离心时间后，应将调速旋扭档逐档旋回至“0”，然后让它自行停转，当离心机自然停止后，取出离心管和离心套管。不允许用手或其他物件迫使离心机停转。严禁在还未停转的状态下和开机运转的状态下打开机盖。 7 倒去离心套管内的平衡用水并将套管倒置于
31、干燥处晾干。 注意事项： （1）离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜。严格按操作规程使用离心机。（2）离心管必须平衡后才能启动离心机。（3）离心机启动后，如有不正常噪音及震动，应立即切断电源，分析原因，排除故障。 （4）在使用过程中，应尽量避免试液洒在机器上面及转头里面，用毕及时清理，擦拭干净。 二、分光光度计1分光光度计的基本构造 无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、光电转换装置和测量仪表。 （1）光 源：分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯。 （2）单色器：把混合光波分解为单波长
32、光的装置。在分光光度计中多用作为色散元件。光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，因而能将不同波长的光分开，玻璃对紫外线的吸收力强，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计；石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用。在石英或玻璃表面上刻划许多平行线（每英寸约刻15,00030,000条），由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱。光源照到棱镜或光栅以前,先要经过一个入射狭缝，再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上。透过棱镜的光再经另一聚光镜，在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图。如在焦线处放出射狭缝,转动棱镜使光谱移动，就可以从出射狭缝射出所需要的单色光。整个装置称为“单色器”。（3）吸收池：吸收池又称比色杯、比色皿、比色池。一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低
