1、回回药方失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织Fas失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织海马区Fas和FasL表达的影响 左艳丽1 于凌志1 王晓丽2付慧玲2贾孟辉2，3 苏丹1 李占涛1（1.宁夏医科大学中医学院 宁夏银川 750004 2.宁夏医科大学第二附属医院 宁夏银川 750001 3.回医药现代化省部共建教育部重点实验室 宁夏银川 750004）摘要： 目的 观察失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织海马区Fas和FasL蛋白表达的影响。方法 将90只 SD大鼠随机分为6组：假手术组、脑缺血再灌注模型组（以下简称模型组）、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知
2、丸高浓度组。各组缺血模型再灌注12h、24h、72h后断头取脑，并检测Fas和FasL蛋白及Fas mRNA和FasL mRNA的表达水平。结果 假手术组Fas和FasL的表达最少，模型组表达最多；与模型组比较，用药组各时段Fas和FasL的表达均减弱，以失荅剌知丸高浓度组的表达减弱显著。结论 失荅剌知丸对脑缺血再灌注损伤具有较好保护作用，其机制可能与抑制海马区神经细胞凋亡有关。关键词：失荅剌知丸；脑缺血再灌注；Fas；FasL脑缺血可以引起脑组织发生局限性或弥漫性的脑功能障碍，进而诱发神经细胞凋亡和坏死，导致脑组织的损伤。现代医学研究表明，神经细胞凋亡的数量决定着脑组织的梗死体积，并直接关系
3、到疾病的转归和预后。因此，尽早地采取有效的抑制和减少神经细胞的凋亡的方法，对脑缺血疾病的转归具有无疑决定性的重大意义。回回药方失荅剌知丸是回医药治疗脑缺血性疾病的传统、经典方药，本课题组前期的系列实验研究业已表明：失荅剌知丸可以激活PI3K-AKT通路的活性，上调PI3K和AKT的表达，抑制神经细胞凋亡；同时可以减少神经毒性，减轻炎症反应1，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、下调促凋亡蛋白Bax、凋亡执行因子Caspase-3、9的表达。为进一步探讨失荅剌治丸抑基金项目：国家自然科学基金（81260568）；银川市科技攻关课题（2012017）作者简介：左艳丽（1990-），女，在读硕士研究生。
4、研究方向：中医药、回医药防治心脑血管疾病的理论和临床研究。E-mail:524023671通讯作者：贾孟辉（1962-），男，主任医师，研究生导师，国基金课题评议专家。主要研究方向：回医药、中医药防治心脑血管疾病的理论及临床研究。E-mail:JJJ94330制海马区神经元细胞凋亡的作用机制，本研究开展了失荅剌治丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织海马区Fas和FasL表达水平的实验研究。具体结果汇报如次。1材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 健康SD大鼠，9只，SPF级，雄性，（28020）g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。1.1.2 实验药品 1.1.2.1 失荅剌知丸 出自回回药方考
5、释，原方组成为柴胡30g， 黑诃子30g，芦荟60g，元胡6g，石菖蒲6g，番盐6g，药西瓜9g，松蕈9g ，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，荜拨3g，白芥子3g，芸香3g，巴豆9g，共计213g，以上所有药物切制后，原生药材（除阿魏外）置于2130ml的蒸馏水内浸泡60min，大火煎煮至沸腾后（阿魏后下），改用小火保持微沸状态再煎煮30min，滤取药液，药渣再加入1704ml的蒸馏水，浸泡30min，大火煎煮至沸腾后，小火保持微沸状态再煎煮30min，滤取药液，合并两次药液，放置于恒温水浴锅中分别浓缩至低浓度1.112g/ml、中浓度2.223g/ml、高浓度4.446
6、g/ml，置于4冰箱备用。1.1.2.2 金纳多 即银杏叶提取物（德国威玛舒培公司）规格40mg20片，临用前配制成1.04mg/ml的混悬液。1.1.3 主要实验试剂 全蛋白抽提试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP250）、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP113）、Western Blotting检测试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司KGP1201）、Fas （中国 武汉博士德生物工程有限公司 BA0484）、FasL （中国武汉博士德生物工程有限公司 BA0049）。1.1.4 实验仪器 PowerPac 基础电泳仪电源（美国
7、 Bio-Rad 164-5051）、荧光定量PCR循环仪（美国ABI Step one plus Real time-PCR system）、紫外光度仪（日本 SHIMADZU UV-2450）、凝胶成像分析系统（SYNGENE G：BOXChemiXR5）、高速冷冻离心机（德国 eppendorf 5024R）、分析天平（德国Sartorius BL310/BL21S）1.2 方法1.2.1 实验分组 90只大鼠采用随机数字表法进行分组，随机分为：假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，每组又分为12h、24h、72h三个亚组，每个亚组6只大
8、鼠。1.2.2 实验给药SD大鼠给药量为1ml/100g，金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组分别给予相应药物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手术组、模型组给予相应浓度的生理盐水。1.2.3 动物模型制备参照改良的Longa法2，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，造成脑缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，沿颈部正中线切开，依次钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将直径为0.24mm的线栓自颈外动脉小切口处插入至颈内动脉，直至感到轻微阻力，长度约为182mm，用手术缝合线将颈外动脉小切口和线
9、栓尾端一起结扎，阻断血流2h后实行再灌注，待大鼠清醒后进行神经功能评分，评分2分者作为模型成功标准。假手术组钝性剥离颈内外动脉后缝合伤口。1.2.4 取材 各组分别于术后12h 、24h、72h取材。麻醉后迅速断头，置于冰浴内快速剥离脑组织，放置于蜡板上切取左侧大脑海马区，放入冻存管内，保存于液氮中。1.2.5 蛋白免疫印迹法（western blot）检测 将冻存组织取出，进行全蛋白提取，取适量样品上清进行SDS-PAGE电泳，转膜后分别加一抗、二抗，加入化学发光试剂，使用G：BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-P
10、CR)： 取待测脑组织，按TRIzol试剂盒说明提取脑组织总RNA，并测定总RNA的含量和纯度。根据总RNA的含量，合成cDNA第一链，以此为模板在荧光定量PCR循环仪（美国ABI Step one plus Real time-PCR system）上进行扩增，同时以无cDNA的反应体系为阴性对照，引物由南京凯基生物公司设计，序列如表1， 反应条件为：95预变性5min，95变性15s，60退火20s，72延伸40s(依次循环40次)，725min，最后利用软件分析得到Ct值和拷贝数。表1 实时荧光定量PCR引物序列 基因 引物序列 长度 (Sense primer) 5 GGCTTAGTG
11、ATTGCATCTCGTT 3 FAS 114bp(Anti-sense primer)5AGGGTCTCTGTCCTCCTTTTGT 3 (Sense primer) 5 GGTGCTGGTGGCTCTGGTT 3 FASL 137bp (Anti-sense primer) 5 TGGGGTTGGCTATTTGCTT 3 1.2.7 统计学处理 采用SPSS19.0进行统计学分析，多组样本均数之间的比较采用单因素方差分析，结果以均数标准差（xS表示），当P0.05时认为差别具有统计学意义。2. 结果2.1 蛋白免疫印迹 结果显示：见图1、图2，表2、表3 。假手术组各时间点FAS、FASL
12、的表达均为最低；模型组各时间点FAS、FASL的表达均为最高；较模型组比较，各用药组FAS、FASL的表达均降低；较阳性药物对照组比较，失荅剌知丸中浓度组没有显著性差别，而失荅剌知丸高浓度组的FAS和FASL表达减少明显，且三个时间点的减少均十分显著。图1 各组大鼠术后海马区FAS蛋白含量电泳条带A B C D E F图2 各组大鼠术后海马区FASL蛋白含量电泳条带A B C D E F(A假手术组，B模型组，C高浓度组，D 低浓度组，E中浓度组，F阳性药物对照组)表2 各组大鼠术后海马区FAS蛋白表达含量比较 FAS Group 12h 24h 72h假手术组 0.040.00 0.020.
13、01 0.020.00模型组 0.370.02& 0.480.02& 0.150.02&金纳多组 0.150.02& # 0.250.03&# 0.190.01&#低浓度组 0.300.01&#* 0.380.01&#* 0.350.02&#*中浓度组 0.170.03&# 0.250.05&# 0.190.03&#高浓度组 0.090.01&# * 0.160.02&#* 0.070.03&#*& P0.01vs假手术组；各用药组vs模型组，#P0.01；同时间点各回药组vs金纳多组*P0.01；表3 各组大鼠术后海马区FASL蛋白表达含量比较 FASL Group 12h 24h 72h假
14、手术组 0.030.01 0.030.01 0.040.01模型组 0.420.03&# 0.510.04&# 0.380.02&#金纳多组 0.240.02&# 0.300.02&# 0.240.03&#低浓度组 0.310.03&#* 0.380.02&#* 0.320.02&#*中浓度组 0.200.02&# 0.320.03&# 0.230.02&#高浓度组 0.140.01&#* 0.210.01&#* 0.160.04&#*同时间点各组vs假手术组&P0.01；各用药组vs模型组，#P0.01；同时间点各回药组vs金纳多组*P0.01；同时间点回药高浓度vs各组P0.012.2 实
15、时荧光定量PCR 结果显示：见图3、图4，表4、表5， 模型组12h、24h、72h FAS mRNA和FASL mRNA的表达水平均显著高于假手术组和各用药组，其中FAS mRNA和FASL mRNA在24h时的表达水平为最高；与阳性药物对照组比较，失荅剌知丸高浓度组12h和72h时FAS mRNA的表达水平降低明显，12h和24h FASL mRNA的表达水平降低明显。图2 各组大鼠术后海马区FAS mRNA扩增曲线图3 各组大鼠术后海马区FASL mRNA扩增曲线表4各组大鼠术后海马区FAS mRNA表达的定量分析比较 FAS Gene Relative Expression Group
16、 12h 24h 72h假手术组 1.010.05# 1.570.17# 0.990.12#模型组 3.430.26* 4.830.38* 3.410.22*金纳多组 0.080.01*# 0.140.01*# 0.060.01*#低浓度组 2.660.13*# 3.400.19*# 2.840.17*#中浓度组 2.100.17*# 2.850.14*# 1.930.12*#高浓度组 0.700.05*# 1.410.15# 0.760.08#*P0.05vs金纳多组；*P0.01vs金纳多组；# P0.05vs模型组；P0.01vs模型组；P0.05vs低浓度组；P0.01vs低浓度组表5
17、各组大鼠术后海马区FASL mRNA表达的定量分析比较 FASL Gene Relative Expression Group 12h 24h 72h假手术组 1.000.04# 1.550.10# 1.020.07#模型组 3.250.13* 4.620.17* 3.200.15*金纳多组 0.160.02*# 0.100.02*# 0.170.02*#低浓度组 2.640.13*# 3.380.12*# 2.590.14*#中浓度组 2.110.31*# 2.670.09*# 2.000.12*#高浓度组 0.890.53# 1.350.11*# 0.750.06*# *P0.05vs金纳
18、多组；*P0.01vs金纳多组；# P0.05vs模型组；P0.01vs模型组；P0.05vs低浓度组；P0.01vs低浓度组3. 讨论脑缺血再灌注损伤发生后，会产生一系列快速的级联反应，最终导致脑组织的损伤3-4。其中，神经细胞的凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节，Fas和FasL作为人体自身耐受机制的介导者、细胞凋亡的诱导者、免疫应答的控制者和免疫赦免的参与者5-6，在正常大脑中少量表达，在病变的神经系统中其表达增加7，当缺血性脑血管疾病发生时，参与并促进脑组织的损伤8。有研究表明，Fas和FasL主要通过三个途径交联诱发细胞凋亡：神经鞘磷脂途径、蛋白酶途径、Daxx(死亡结构域关联蛋
19、白)途径，以上几个途径彼此交联，互相影响，推进着脑缺血再灌注损伤的进程。（1）神经鞘磷脂途径：缺血再灌注损伤的外源性刺激后，Fas死亡域与FasL相关的死亡域结合,激活酸性神经鞘磷脂酶,随之水解神经鞘磷脂而产生神经酰胺,通过应激反应，激活蛋白激酶(SAPK)和Jun N末端激酶,活化细胞色素C相关蛋白酶而启动凋亡的发生9。（2）细胞接受凋亡的信号刺激，FasL与Fas结合并诱导Fas三聚化，其中的死亡域与死亡结构域相关蛋白（Fas associated death domain,FADD）结合，并将凋亡信号传递给胱冬酶8（caspase-8），促使Fas、FADD和 Caspase-8形成死亡
20、诱导信号复合体（DISC），Caspase-8进行自我剪切10，激活下游的Caspase-3、6和7，导致细胞凋亡11。（3）Daxx途径：细胞接受凋亡信号刺激后，Fas的死亡域与Daxx的C末端一个功能区结合，通过激活Jun N末端激酶(JNK)途径而启动凋亡的发生。在多种应激情况下，Daxx可以诱导Fas表达，引起细胞凋亡12。以上三个途径相互联系，互相影响，诱导神经细胞凋亡，增大脑组织的梗死体积，加重患者的临床症状。中国回族医药疗法属于绿色自然疗法之一，其作为民族医学的重要分支，丰富和完善了我国民族医学在脑部疾患的预防和治疗方面的经验。回族医学理论认为，脑藏于颅内，总司觉之力，占主要地位
21、，起主导作用。冷（寒）胜，剐脑于阳外，妨碍“通”使传导能力，脑之总觉之力困冷，凝滞经络而不得通达于外，影响百体之知觉运动，神经-体液系统亦不得正常转输13。回回药方于元末明初成书，是目前保存中最早的中国回医药百科全书。其“众风门”篇中包括脑系疾病的生理病理观、内外科临床辨治等众多内容，为现代指导运用回族医药治疗脑系疾病提供了充足而完备的资料。 失荅剌知丸出自回回药方“众风门”，主要由柴胡、黑诃子、芦荟、元胡、石菖蒲、药西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、荜拨、白芥子、芸香 等药组成，可“开缠肠肚风病，通经络”，具有芳香通窍，利痰化湿，祛寒通络的功效，用于治疗中风后骨节疼痛，左瘫右痪，口眼歪斜，半
22、身不遂等症状。已有研究表明，失答剌知丸能够通过抗炎，加强血管通透性，增强药物透过血脑屏障的能力，增加药物在脑组织内的蓄积时间，对抗缺血缺氧引起的神经元损伤，以达到保护脑组织，改善患者症状的作用。 本研究结果显示，脑缺血再灌注损伤后，海马区的凋亡细胞显著增加，于24h达到高峰，72h后下降，与文献报道一致14，较模型组相比，各治疗组凋亡细胞数量均下降，且不同浓度的失答剌知丸下调水平有所差别。Fas和FasL在脑组织缺血缺氧后，大量、快速表达以促进神经细胞凋亡，增大坏死体积，本实验研究结果表明，不同失答剌知丸较模型组相比，能够明显下调海马区Fas和FasL蛋白表达及Fas mRNA和FasL mR
23、NA的含量，较阳性药物对照组相比，高浓度额失答剌知丸下调水平更强，阻抑神经细胞凋亡效果更显著，说明失答剌知丸可以通过阻断神经细胞凋亡而发挥保护脑组织的功用。由此可见，民族医药在预防和治疗脑部疾患方面具有肯定的疗效，值得大力开发推广和应用。参考文献：1 王佩佩，贺晓慧，刘耀龙，等.失荅剌知丸对脑缺血大鼠再灌注后神经功能缺损及脑组织PI3-K 和 AKT表达的影响J.宁夏医科大学学报，2014，36(5)：473-477.2 Zea Longable E，Weinsten PR，Carlson S， et al. Reversible middlecerebral artery occlusion
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