1、血培养操作规程血液标本检验程序1.概述：正常人的血液及骨髓是无菌的，当细菌侵入血液时，则可引起菌血症，败血症或毒血症，侵入骨髓可引起严重的骨髓炎。因此细菌学检验对其诊断和治疗具有重要的意义。检验目的：检出血液及骨髓标本中的病原微生物并进行体外药物敏感性试验，为临床抗生素使用提供依据。2.目的：规范微生物血液标本检验程序，以保证微生物检验工作和检验质量的正确进行。3.范围：适用于血液和骨髓标本。4.程序原理：根据培养阳性细菌的形态特点、菌落特征及生化反应特点，鉴定细菌种类，后根据CLSI推荐选择抗生素试验方法。5.血液培养报告要严格遵守三级报告制度和危急值报告制度。6.所用设备：Versa-TR
2、EK血培养仪、VITEK2全自动细菌鉴定/药敏分析系统、YQS-II厌氧培养箱、II级生物安全柜、显微镜、恒温培养箱、红外线高温灭菌灯、接种环。7.试剂：成人需氧和厌氧血培养瓶、革兰染色液、各种培养基、Vitek 2鉴定卡、K-B药敏和MIC药敏试验试剂、厌氧指示剂 、无菌盐水、接种槽、反应板、触酶试剂、氧化酶试剂、凝固酶试剂、药敏纸片等等。8.标本采集：见微生物标本采集和送检程序（YLJY-WSW-PF-6-8）。9.检验程序：9.1本实验室所有血液和骨髓标本均同时进行需氧和厌氧培养(厌氧培养瓶内含85的N2、1OCO2、5H2的厌氧气体)。接到血培养标本后，根据采样时间，在室温放置20-3
3、0分钟。9.2将病人信息输入，在仪器上扫描培养瓶条型码。具体操作按Versa-TREK血培养仪标准操作规程进行。9.3培养瓶进入Versa-TREK血培养仪系统后，当被注入样本的培养瓶中有微生物存在时，它们就会在培养液中进行新陈代谢，释放处二氧化碳，CO2 + H2O=H2CO3，解离后成H+和HCO3，在酸性环境下使培养瓶底部灰绿色变成不可褪色的黄色，仪器每10分钟读取数据，一旦计算机系统对检测到的原始数据采用一定的计算法判断被检测样本是否有微生物的存在，此时仪器会自动以声音和屏幕变黄报警，提示有阳性瓶出现。9.4根据“Versa-TREK血培养仪标准操作规程”卸下阳性瓶，根据所检阳性瓶结果
4、选择培养基。如果需氧瓶阳性则选择血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿、如果厌氧瓶阳性选择血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿、麦康凯平皿和哥伦比亚厌氧血平皿；如果涂片看到真菌样孢子或菌丝，则增加沙保弱琼脂平皿，必要时加玉米和土豆琼脂平皿，置孵箱350C培养。厌氧菌培养经48-72小时培养后，打开厌氧箱，并作耐氧试验，将同一菌落分别置需氧培养18-24小时及置厌氧培养48-72小时。同时作涂片和初步药物敏感试验，将涂片结果电话报告临床医生，此报告为一级报告，并根据科内和微生物电话报告制度进行记录。8小时后报告初步药敏结果为二级报告。9.5 转种平皿经18-24小时孵育后，作进一步鉴定和正式药敏试验。不同细菌鉴定参照
5、其相应检查程序进行，做出最终报告。9.6厌氧菌鉴定选择耐氧试验阳性菌株，行厌氧菌鉴定（Vitek2。若系统最终报告为阴性，也应转种厌氧血琼脂证实无菌生长后方可报告阴性结果。推荐厌氧菌血液培养最终报告时间为1周。厌氧菌感染对临床有重要意义应予高度关注，及时与临床联系。9.7若培养瓶在预置时间内未呈现阳性结果，除特殊情况需将瓶内培养液转种血琼脂平皿， 一般情况无细菌生长即可报告经XX天培养无细菌生长。榆林市第一医院检验科微生物室程序文件七 微生物室临床标本检验中程序02血液标本检验程序文件编号：YLJY-WSW-PF-7-2版本-修改号：1-01生效日期：2014-04-019.9血液及骨髓检验流
6、程图榆林市第一医院检验科微生物室程序文件七 微生物室临床标本检验中程序02血液标本检验程序文件编号：YLJY-WSW-PF-7-2版本-修改号：1-01生效日期：2014-04-019.10各种细菌检测参照其各自检测程序进行。9.11血液培养阳性属微生物危急报告值，检验医师和技师要特别记录加以追踪，如果怀疑污染应立即通知临床再次送检。10.质量控制： Versa-TREK全自动血液培养系统质量控制、VITEK 2鉴定系统质量控制、涂片染色质量控制、培养基质量控制、K-B法和MIC药敏试验质量控制、氧化酶试验质控、触酶试验质控，具体操作参照各自程序。11.报告制度：11.1培养系统提示有细菌生长
7、，要立即涂片，革兰染色镜检，电话通知主管医生，为一级报告；将可疑生长的培养瓶转种相应培养基上，并作初步药敏试验，经6-8小时培养后，将结果电话通知主管医生，提示高度敏感的抗菌药物，为二级报告；完成鉴定及标准化的药敏试验，并发出正式的细菌检验报告单为三级报告。11.2若培养5天仍无细菌生长者，报告无菌生长。11.3 临床诊断为亚急性细菌性心内膜炎者，可继续培养至2周再发出阴性报告，但自动血液培养仪在5天作出阴性报告，因此可以人工延长时间。12.常见细菌与临床意义：12.1血液培养是用来发现、识别细菌或其它可培养分离的微生物，这些微生物侵入血液中，迅速繁殖超出免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血
8、症或真菌菌血症。12.2常见的革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、A群B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、炭疽芽孢杆菌、厌氧链球菌、产单核李斯特菌、丙酸杆菌、念珠菌、结核分枝杆菌等。12.3常见的革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、伤寒及其他沙门菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌科细菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌、其他假单胞菌、不动杆菌、流感嗜血杆菌、布氏杆菌等。12.4葡萄球菌：葡萄球菌属于微球菌科，已知葡萄球菌属有28个种，其中14个种可从人类临床标本中分离到。以血浆凝固酶作为分离标准可将其分为二大类：一类是金黄色葡萄球菌：引起人类感染的最主要的葡萄球菌，占葡萄球菌菌血症的
9、90。耐甲氧西林金黄色葡萄球（MRSA）常呈多重耐药，使用万古霉素治疗死亡率仍可达10-30，因此MRSA的确定要及时准确。另一类是凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）：葡萄球菌菌血症的患者中有10是由于凝固酶阴性葡萄球菌所致，多见化疗、激素、放射治疗者。CNS已成为医院导管治疗的主要致病菌，耐苯唑青霉素的凝固酶阴性的葡萄球菌（ MRCNS）其耐药性较MRSA更高。12.5链球菌：A群链球菌是引起化脓性感染的主要细菌，致病力强。B群链球菌（无乳链球菌），近十年来感染也有所增加。绿色链球菌可致亚急性细菌性心内膜炎。其中缓症链球菌、唾液链球菌、犬血链球菌、米勒链球菌多见，缓症链球菌耐药性强。 肺炎链球菌可
10、导致血流播散，而导致败血症。此外还应注意发现营养变异链球菌；该种细菌的生长需要补充巯醇复合物和维生素B6。血培养基中含有足够的营养成分使营养变异链球菌生长。然而传代培养时，培养基中需要补充盐酸-磷酸吡哆醛（0.001%）或L半胱氨酸（0.05%至0.1%）或二者皆有，否则营养变异链球菌不能生长。也可将血培养物传种至血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄球菌，在金黄色葡萄球菌菌落周围有营养变异链球菌卫星样菌落。12.6肠球菌是医院内感染中常见病原菌之一。引起人类感染的主要是粪肠球菌、屎肠球菌和鸟肠球菌,庆大霉素高耐菌株(HLAR)多见屎肠球菌。万古霉素是高耐肠球菌的首选药物。12.7奈瑟菌属：
11、 脑膜炎球菌是引起脑膜炎的病原菌，可侵入血液，冬春季为发病高峰期。卡他布兰汉菌感染引起中耳炎、化脓性支气管炎和肺炎时可入血液。12.8革兰阳性杆菌： 产单核李斯特菌在近年的感染中呈下降趋势。炭疽杆菌为人畜共患传染病，分皮肤炭疽、肺炭疽、纵隔炭疽和肠炭疽，三型均可能并发败血症。从艾滋病发现以来，已从部分例数患者血液中分离出鸟复合分枝杆菌及结核杆菌等，因此血液分枝杆菌培养已引起广泛重视。分枝杆菌的血液感染常发生于初染结核病患者、免疫力低下患者，艾滋病患者为易感染者，鸟分枝杆菌对抗结核药物不敏感或产生耐药。12.9革兰阴性杆菌： 在常规血液培养中革兰阴性菌引起的菌血症约占71.4。肠道革兰阴性杆菌引
12、起肠外感染而导致败血症的主要菌种有伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、气单胞菌、布鲁菌和沙雷菌等。非发酵革兰阴性杆菌：铜绿假单胞菌常发生于大面积创伤后。可术后经感染、褥疮、脓肿等导致血行播散。不动杆菌属当人体抵抗力下降时，因局部感染而导致血液感染，败血症发生率有上升趋势。嗜麦芽窄食单胞菌呈多重耐药，产金属-内酰胺酶是其主要耐药机制，首选治疗药物是复方磺胺甲恶唑、替卡西林钠克拉维酸钾（特美汀）和多西环素（强力霉素）。洋葱伯克霍德菌可引起免疫低下患者心内膜炎和败血症。其他革兰阴性杆菌 流感嗜血杆菌：可入侵血流。心杆菌属：当机体抵抗力下降时，可引起心内膜炎入血流。链杆菌属代表菌种是念珠状链杆菌，对
13、各种抗菌药物均较敏感。多杀巴斯德菌可通过猫或狗咬伤、抓伤感染或与动物接触的工作人员，可引起菌血症和败血症。放线杆菌属有5个种即李氏放线菌（ALignieresii）、马驹放线杆菌（A.equuli）、猪放线杆菌（A.Sals）、荚膜放线杆菌（A.Capsulatus）和伴放线放线杆菌（A.actinomycete-mcomitans），除荚膜放线杆菌外，其他4个种均可引起人类败血症或心内膜炎。12.10细菌L型：血液中很少分离出细胞壁缺陷的细菌。含10%蔗糖或甘露醇渗透压恒定的培养基，适合培养细胞壁缺陷的细菌。该培养基也适合某些细胞壁完整的细菌生长，因此在这类培养基中分离出某种细菌，并不意味着
14、血液中一定有细菌L型。12.11真菌血症常发生于重症疾病的晚期，特别是应用广谱抗生素和皮质激素后，如白血病、粒细胞减少症、再生障碍性贫血、癌症、结核和艾滋病人。由于机体免疫功能低下，在原发病灶加重的同时，常发生继发感染及二重感染。任何部位，尤其是正中静脉插入或留置导管均可引起真菌感染，以白色假丝酵母菌为主。器官移植或血液病患者长期使用免疫抑制剂，侵袭性真菌呈上升趋势。曲霉菌感染常表现为三种不同临床型，既过敏型、真菌球型（曲菌病）和肺炎型三种，可通过血流引起败血症，曲霉菌引起的败血症死亡率可达95以上。因此分离出曲霉菌不能轻易判定为污染菌而丢弃。毛霉菌可引起以急性坏死性炎症为主的疾病，主要侵害血
15、管，引起血栓，并可经血液转移，全身毛霉菌病一旦发生，最终多导致死亡。 多种方法可提高血液中真菌的检出率，包括使用需氧血培养瓶、双相培养基、裂解-离心技术和特殊营养的肉汤培养基（如脑心浸液肉汤等）。裂解-离心技术是一种分离真菌的有效方法，特别是对于营养要求苛刻的双相真菌。实际上，大多数需氧血培养瓶，孵育57天，可提供充足的营养使白念珠菌生长良好。然而对于非白念珠菌、光滑球拟酵母菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和其它双相真菌，使用裂解-离心技术可获得最高的检出率，通常采用霉菌抑制琼脂(Inhibitory mold agar) ，脑心浸液琼脂和巧克力琼脂与Isolator管结合使用。阴性的真菌血培养
16、应于2230oC孵育4周后发终报告。12.12 厌氧菌：引起的血液感染占菌血症的20，其中45是单纯厌氧菌感染，病死率达50。菌血症的细菌种类可因原发性感染和手术、外伤部位不同而异。产后菌血症大多由羊膜炎，子宫内膜炎等原发病灶引起。阑尾炎、溃疡性结肠炎、胃肠肿瘤、肺部感染、口腔感染、子宫积脓、褥疮溃疡等亦可发生菌血症。厌氧菌菌血症分离出的常见厌氧菌有脆弱类杆菌、产黑色素普雷沃菌、具核梭杆菌、消化球菌、消化链球菌、韦荣球菌等，并多与兼性菌 混合感染。败血症是一种严重危急生命的感染性疾病，细菌学检验应采取各种手段，加速病原菌分离鉴定工作，发现阳性及时报告，并主动进行该菌的药物敏感测定，尽快为临床提
17、供信息，以利抢救。 13 参考文献13.1叶应妩,王毓三,申子瑜. 全国临床检验操作规程.第三版 南京：东南大学出版社，2006.1013.2丁振若,于文彬,苏明权，郝晓柯主编.现代检验医学.北京：人民军医出版社，2007.113.3张卓然主编.临床微生物学和微生物检验.第三版.北京：人民卫生出版社，2003.313.4中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007.13.5中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008.13.6周庭银，
18、倪语星主编.临床微生物检验标准化操作（ISO15189认可指导书）.上海.上海科学技术出版社.2009,5.14 支持文件1.微生物标本采集和送检程序 YLJY-WSW-PF-6-82. Versa-TREK血培养仪仪器操作作业指导书YLJY-WSW-SOP-19-43.VITEK-全自动微生物分析仪操作作业指导书 YLJY-WSW-SOP-19-15.BIOBASE 型生物安全柜操作作业指导书 YLJY-WSW-SOP-19-96. Heraeus CO2培养箱操作作业指导书 YLJY-WSW-SOP-19-137. YQS厌氧培养箱操作作业指导书 YLJY-WSW-SOP-19-128.
19、危急结果和三级报告制度 YLJY-WSW-QM-4-715 记录表格1.血液培养仪上机登记本2.血液培养仪日常维护登记本3.血液培养原始申请记录单4.血液培养最终报告(电子版)5.危急值登记本6.临床沟通登记本血培养检测规范化操作（世上最全基本操作流程）2016-08-22来源:南方检验医学网阅读:1291次【字号：大中小】导读：一、血培养检测 采血指征： 对入院的危重患者未进行系统性抗生素治疗前，应及时进行血液培养，患者出现以下体征时可作为采集血培养的重要指征： 1 发热（38）或低温（36）。 2 寒战。 3 白细胞增多（1010 9/L，特别有核左移未成熟的或带状的白细胞一、血培养检测
20、采血指征：对入院的危重患者未进行系统性抗生素治疗前，应及时进行血液培养，患者出现以下体征时可作为采集血培养的重要指征：1 发热（38）或低温（36）。2 寒战。3 白细胞增多（1010 9/L，特别有“核左移”未成熟的或带状的白细胞增多。4 粒细胞减少（成熟的多核白细胞110 9/L）。5 血小板减少。6 皮肤粘膜出血。7 昏迷。8 多器官衰竭。或同时具备上述几种体征时应采血培养。在评估可疑新生儿败血症时，除发热或低烧外，很少培养出细菌，应该补充尿液和脑脊液培养。肺炎链球菌与流感嗜血杆菌菌血症的患儿（特别是2岁以下的幼儿）一般多见于门诊，常伴有明显发热（38.5）和白细胞增多（20109/L）
21、。老年菌血症患者，可能不发热或不低热，如伴有身体不适，肌痛或中风可能是感染性心内膜炎的重要指征。血培养检测 皮肤消毒程序：血培养为防止皮肤寄生菌污染，可使用消毒剂（碘酊或碘伏）对皮肤进行严格仔细的消毒处理，最大限度地减低皮肤污染。感染性心内膜炎，特别是心脏瓣膜修复术的感染，可能由皮肤寄生的微生物引起（例如：表皮葡萄球菌或棒杆菌属）。因此，在采集过程中血培养的污染一定要减小至最低程度。用做培养的血液均不应该在静脉或动脉的导管中抽取，除非静脉穿刺无法得到血液或用来评价与导管感染相关性指标。如果抽取了导管血，也应同时在其他部位穿刺获取非导管内静脉血液进行血培养。皮肤消毒严格按以下步骤进行：1 首先用
22、70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。2 然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1%-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），从穿刺点向外以1.5cm2cm直径画圈进行消毒。3 最后用70%酒精脱碘。严格执行三步消毒后，可行静脉穿刺采血。注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒钟，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。血培养检测 培养瓶消毒程序：1 用70%酒精或碘溶液（不要使用碘）消毒血培养瓶橡皮塞子。2 酒精作用待60秒。3 在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。要点：血培养的关键是防止皮肤寄生菌或环境引起的污染，由污染菌引起的假阳性增加了患者
23、抗生素的使用量，延长了住院日，延误病情诊断并增加了经济负担等。然而，在理想的消毒条件下，仍有3%5%血培养中混有污染菌，它们来源于皮肤（表皮葡萄球菌，痤疮丙酸杆菌，梭杆菌属，类白喉群）或来源于环境（革兰阳性芽孢杆菌属，不动杆菌属），这些微生物有时有致病作用。对两次不同部位血培养生长同一种微生物，不同类无菌部位标本培养中生长同一种微生物，微生物快速生长（48h内）。上述情况下，应考虑是真正的感染。临床实验室工作人员和医生之间应经常讨论血培养结果，建立良好的交流关系对各方面都有益处。例如查病例回顾性调查分析：19951999年血中分离的70例凝固酶阴性葡萄球菌，入院48h内检出者，39.3%（24
24、例）为污染菌，48h后检出者（9例）100%为污染菌，污染菌检出时间显著长于病原菌。提示血培养中凝固酶阴性葡萄球菌污染率较高。因此，采血前严格执行皮肤消毒程序非常重要。血培养检测 采血量：对从菌血症或真菌菌血症患者血培养中获得微生物，每个培养瓶抽取的血量是唯一重要的变量。当培养的血量从2ml增加到20ml时，血培养的阳性率增加30%50%，因为培养的血液量增加1ml，阳性率增加3%5%。用静脉穿刺获得的血量，成人和儿童不同。儿童，特别是新生儿很难获得大量的血液，对婴幼儿和儿童，一般静脉采血1ml5ml用于血培养，当细菌浓度足够高时，血液少于1ml也足以检测菌血症。标本量大于1ml，细菌量也增加
25、，对于感染的儿童没毫升血液比成人有更多的微生物。对于成人血培养的标本量少于10 ml不易培养出细菌，每瓶最低限量应是10ml血液，20ml30ml最合适，血液和肉汤的比一般推荐为1:5至1:10。几乎所有现代的血培养系统假如血液量均在10ml以上。虽然静脉采血30ml可增加细菌量，但这不太切合实际，这很容易造成医院获得性贫血。血培养的数量和采血时间：血培养的数量和采血时间关系到菌血症的病理生理学，一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单次血培养。研究已经证实，采集适量的血液注入23瓶血培养瓶中足以检测所有的菌血症和真菌菌血症。对间歇性菌血症，用于培养的血液应在估计寒战或体温高峰到来之前采集，因为
26、细菌流入血液与寒战发作通常间隔1h，在发烧时血液可能没有细菌，实际上，血培养通常是在寒战或发烧后进行。由于细菌很快会从血液中清除，因此，在寒战或发烧后应尽快抽取血培养。正是由于这个原因，我们一般不推荐在任意时间抽取静脉血进行培养，研究资料表明任意时间采血并不能提高微生物的检出率。实际上已经证明在24h内同一时间或任意时间抽血培养发现微生物的结果相似。无论何时，采集血培养应该在使用抗生素之前进行，推荐同时采集23瓶，每瓶20ml30ml血样进行培养来做最初的平谷，这也更切合实际。先前饿抗生素治疗可能导致血培养结果阴性，微生物延迟生长更为常见。有研究证实，对链球菌心内膜炎患者，在做血培养的前两周内
27、患者接受了抗生素治疗，血培养的阳性率从97%下降到91%。由于有很好的血培养技术，对感染性心内膜炎患者血培养的阳性率应该达到95%以上。对特殊的全身性和局部感染患者采集血培养的建议：1 怀疑记性原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎的患者：应立即采集2或3份血培养瓶，快速进行血培养。2 不明病源的发热，如隐性脓肿，伤寒热和波浪热：发热开始采集2或3份血培养。24h至36h后，估计温度升高之前（通常在下午）立即采集2份以上血培养。3 怀疑菌血症或真菌菌血症，血培养结果持续阴性，应改变学培养方法，以便获得罕见的或苛养的微生物。4 感染性心内膜炎，对急性心内膜炎患者1h（2h内）采集
28、3份血培养，如果所有结果24h后阴性，再采集3份血培养瓶。入院前两周内接受抗生素治疗的患者，连续三天采集血培养，每天2份。要点：大部分临床医生对成年患者采集血量不足，采集血培养份数不够，采血时机不合适，通常在患者体温高热时，24h内采集一瓶血培养，降低了血培养的阳性率，不符合才学的基本规程，实验室应该做大量宣传沟通工作。血培养检测 运输标准：采血后血培养瓶或采集管应立即送到临床微生物实验室。血培养瓶和采集管短期内置于室温不影响细菌检出，不要冷藏，如果血培养瓶在送往实验室培养或自动化仪器检测之前不得已需放置一段时间，应置于3537孵箱中。但含血液的采集管不应置于孵箱中，若有细菌生长会释放出一些气
29、体，采集管有破裂或渗漏的危险。实验室收到血培养瓶后立即进行肉眼观察微生物生长情况。采用自动化连续检测血培养系统，有一点很让人忧虑，那就是标本运送有时被延误，这样会导致微生物检测延迟（尽管微生物生长不受影响），目前很少有人注重这一点。尽管自动化连续检测系统有允许延迟上瓶检测微生物生长的原理，培养瓶在运送过程中还应尽量减少延迟。血培养检测 接受标准：实验室收到血培养后，应按以下步骤操作：1 检查培养瓶确保它们被安全地放置。2 用肉眼观查微生物生长的情况，注意血液层上面是否有絮状沉淀、均匀的或表面下的浑浊、溶血、液体培养基凝固、有一层表面薄膜、产生气体、血层表面或深层有白色颗粒等，如有上述情况产生提示有微生物生长。
