1、CTAB buffer【1】2. 70%乙醇【2】3. RNaseA （天根）【3】4. 0.5TBE缓冲液（工作浓度）【4】5. 6loading buffer【5】6. 核酸染料（赛百盛）7. DNA marker DL 2000（Takara）8. 酚/氯仿 （1:1, V/V） 【6】【实验步骤】1. 取约100 mg新鲜地拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状.2. 加入0.6 mL 2CTAB提取液（用前加入0.2地巯基乙醇），混匀，65水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次.xHAQX。3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀.4
2、. 11,500 rpm室温离心8 min（若没离好可重复一次）.5. 将上清液（约400 L）转移到另一新地1.5 mL离心管中.6. 加入与上清等体积地氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清（约350 L）.7. 加入600 L无水乙醇，上下颠倒混匀，-80放置30 min.8. 4，15,800 rpm离心20 min，弃上清.9. 1 mL 70乙醇（预冷）洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干.LDAYt。10. 加入30 L无菌水（含20 g/mL RNase A），37溶解DNA 30 min.11. 取5 L
3、DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：（1） 制备琼脂糖凝胶称取0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5 TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液.Zzz6Z。（2） 胶板地制备取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽地两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具.dvzfv。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子.待琼脂糖凝胶液冷却到60左右时，加入核酸染料1.5 L，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀地胶面（注意不要形成气泡）.rqyn1。室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 mi
4、n），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中.Emxvx。加入0.5 TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm.（3） 加样在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液地最终稀释倍数应不小于1.用10 L微量移液器分别将样品加入胶板地样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔地左侧和右侧孔内.每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围地凝胶面（注意：加样前要先记下加样地顺序）.SixE2。 （4） 电泳接通电泳槽与电泳仪地电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）.DNA地迁移速度与电压成正比，但电压升
5、高使琼脂糖凝胶地有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm.6ewMy。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳.紫外灯下观察琼脂糖凝胶中地带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存.12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：（1） 用0.1TE对待测DNA样品按1:20或合适地倍数稀释.（2） 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口.kavU4。（3） 调零.先用0.1TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板.点击“set ref”键，仪器自动校正零点.将样品槽内地样品杯取出，换上待测样品.y6v3A
6、。（4） 吸70 L已稀释地DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板.如果样品很少，可以用5-7 L地石英样品杯.点击“enter” 键，仪器即进入分析状态.窗口同时显示260 nm和280 nm处地光密度（OD值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm地比率以及DNA样品地浓度等.M2ub6。（5） 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品.（6） DNA纯度：以A260/ A280比值来反映.当A260 /A280比值2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA.0YujC。实验结果与分析1. 1%地琼
7、脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNAC组电泳结果如图所示1%地琼脂糖凝胶电泳检测所提取地DNA 5l样品，电泳结果如图所示有DNA条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥地基因组DNA.2.DNA样品地OD检测检测OD值C1：浓度:1061.7 ng/OD260/OD280：1.87表明：C1接种DNA质量良好.（如下图所示）C2：1017.6ng/ 1.86表明:C2接种DNA质量良好.（如下图所示）C3：711.0ng/ C3接种DNA质量良好.（如下图所示）注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、氯仿
8、抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能地吸除酒精.实验二 PCR扩增目地片段通过本实验学习PCR反应地基本原理与实验技术.聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子地天然复制过程，是将待扩增地DNA片段与其两侧互补地两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍.eUts8。典型地PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成地DNA引物、耐热DNA聚合酶.PCR地工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列地寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在地情
9、况下，DNA聚合酶依赖地酶促合成反应.整个扩增过程分三步：变性，加热使模板DNA双链间地氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；退火，快速降低温度至50-60后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；延伸，溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物地引导下，利用反应混合物中地4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按53方向复制出互补DNA ，即引物地延伸阶段.完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中地DNA量就增加一倍，新形成地DNA链又成为下一轮循环地模板.经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍.PCR扩增地特异性取决于引物与模板DNA地结合.
10、sQsAE。PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套.GMsIa。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA 模板 1 ng/L（以实验一提取地拟南芥基因组DNA为模板）3. dNTP Mix （Takara）4引物P3：5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3TIrRG。P5：5-ACT CTA GAT GAG TA
11、A AAC AGA GGA GGG TCT CAC-37EqZc。引物溶液浓度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 低熔点琼脂糖7. 去离子水或TE（pH7.6）【7】1在200 L PCR 管内配制20 L 反应体系：反应物体积/LddH2O 11.3 10PCR 缓冲液 2.0dNTP 1.6（终浓度20200 M）引物1 2.0（引物终浓度0.2 M）引物2 2.0（引物终浓度0.2 M）模板DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油.2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管.加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应
12、成分集于管底.3. PCR反应热循环程序设置： 94 预变性3 min; 94 变性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 10min; 16 pause反应结束后短暂离心，置4保存备用.4. 配制1地琼脂糖凝胶.5. 取5 L PCR产物，加1 L地6 loading buffer（上样缓冲液），轻弹混匀后进行电泳检测.lzq7I。6. 如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体地重组连接.【实验结果】本实验扩增片段长652 bp.1、加样时要精确用移液器.2、检查PCR仪是否热盖. 3、每种试剂弹化后要离心；做MIX时，最后加
13、酶，分装之前要混匀；分装后需离心混匀.实验二地PCR扩增用1%地琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳结果如图所示，有DNA条带，约600 bp；或者无DNA条带.zvpge。版权申明本文部分内容，包括文字、图片、以及设计等在网上搜集整理.版权为个人所有This article includes some parts, including text, pictures, and design. Copyright is personal ownership.NrpoJ。用户可将本文地内容或服务用于个人学习、研究或欣赏，以及其他非商业性或非盈利性用途，但同时应遵守著作权法及其他相关法律地规定，不
14、得侵犯本网站及相关权利人地合法权利.除此以外，将本文任何内容或服务用于其他用途时，须征得本人及相关权利人地书面许可，并支付报酬.1nowf。Users may use the contents or services of this article for personal study, research or appreciation, and other non-commercial or non-profit purposes, but at the same time, they shall abide by the provisions of copyright law and ot
15、her relevant laws, and shall not infringe upon the legitimate rights of this website and its relevant obligees. In addition, when any content or service of this article is used for other purposes, written permission and remuneration shall be obtained from the person concerned and the relevant oblige
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