1、 必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率95%。相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。2.2转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统（transcription mediated amplification,TMA）和核酸序列依赖扩增系统（nucleic acidsequence based amplification,NASBA）。TMA是一种利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）
2、逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录, 逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。2.3 其它NAT技术包括支链DNA检测技术
3、（branched DNA signal amplification assay,bDNA）、环介导的等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification,LAMP）、连接酶链技术（ligase chain reaction, LCR）和链置换扩增（strand displacement amplification,SDA）等。这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。如bDNA技术，在1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶（AP）标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNA技术对待测DNA无扩增,
4、特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。3.NAT在国内外血液筛检中的应用3.1 开展NAT检测的国家及所用的技术NAT是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检12，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV NAT筛
5、检的国家13,新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检; 德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检; 美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。开展NAT检测的国家及其所采用的技术见表1：表1.开展NAT检测的国家及所用技术汇总国家或地区技术混合检测单检 Germany德国（1997年起部分,1999年月起，全部） Netherlands荷兰（1997年起） U.K. 英国（2000年起） Switzerland瑞士 Japan日本（1997年月起对原料浆；1999年初起献
6、血者） Canada加拿大 USA美国（1999年3月起） New Zealand新西兰 Australia澳大利亚 Singapore新加坡 Portugal葡萄牙 France法国（2000年起） Spain西班牙 Italy意大利 Hong Kong香港 台湾（2005年准备中） 韩国（2005年1月起） PCR TMA/PCR TMA TMA TMA / PCR Pool pool pool/IDT IDT pool / IDT Pool / IDT各国采用的技术各不相同（参见表1）。日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的Ampli NAT NPX系统（为荧光PCR技
7、术，可同时联合检测HBV,HCV和HIV），目前正在考虑使用Chiron公司的TMA技术;美国ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术;美国血液中心（ABC）系统则使用罗氏COBAS Ampli Screen; 荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBAS Ampli Screen扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBAS Ampli Screen扩增体系结合起来的方法, 随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。各血站根据自身特色, 正在对各种不同的技术组
8、合进行评估, 目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。3.2 国外献血员中NAT检测结果从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，具体检测结果见表2。表2国外献血员中NAT检测结果汇总国家试剂检测方式血清学阴性、NAT单独阳性检出情况文献美国Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay;RocheCobas AmpliScreen HIV-1 and HCV testsChir
9、on: 16人份，TMA, 化学发光检测；Roche：24人份混合，PCR-ELISA1999.03-2002.03:HCV NAT+：170/39,721,404，即1/ 23万；HIV-1 NAT+：12/37,164,054，即1/310万文献14 日本Multiplex HBV/HCV/HIV-1 reagent（ Roche 与日本共同研制） 1999年7月1日-2000年1月31日，500人份；2002年2月1日起，50人份混样;合格血液检测1999.72000.4：HBV NAT+：262560977，即1/9.8万；HCV NAT+92560977,即1/28.4万；0256.
10、1万。2000.2.12002.12.31：HBV NAT+：308 16012175，即1/5.2万；46 16012175,即1/34.8万；616012175，即1/266.9万文献15,16 澳大利亚2个点单人份，3个点16人份，TMA, 化学发光检测；2000.06.07-2004.11.14：HCV NAT+-：9/4,489,550，即1/49.9万；1/4,489,5504，即1/449.0万4,489,550文献17及个人交流（文献18）中欧HCV PCR: Roche Cobas Amplicon; HIV PCR: 自己研制的PCR 96人份混合6/360万，1/60万；
11、HIV NAT+：2/360万，1/180万 文献19 法国Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV；或Roche Cobas Ampliscreen HIV-1 and HCV结合the Organon Nuclisens 核酸提取仪 单检，或8人份，或16人份,不考虑血清学2001.07-2003.12：3/614万，即1/205万；2/614万，即1/307万文献20 新加坡 单人份检测 2000.10-2004.10:4304,715,即1/7.6万；0304,715，即0/30.5万个人交流（文献21）韩国16人份2004.06.14-2004.12.03，前期评估
12、：单采献浆者24599，献血者15597: HCV NAT+：1/40196；HIV NAT阳性：2005.01.01起，常规检测个人交流（文献22）南非单人份1999年:HIV NAT+: 2/19709,即1/1.0万；HCVNAT: 0/19709文献23 3.3我国核酸筛查技术应用研究情况3.3.1 我国核酸筛查技术应用我国有关NAT血液筛检研究的报道还比较少见。比较规范的血液筛检研究更少，有的单位利用国产PCR试剂加电泳检测的方法进行检测，其实验室交叉污染的问题很难控制。有关我国献血者及原料浆中NAT检测工作的情况总结于表3和表4。表3 国内血液中心开展NAT检测研究的情况单位NAT
13、阳性深圳保安区中心血站美国Biotronics TechHBV,HCV AmpliSensor试剂盒20人份混合15000rpm离心浓缩，半自动荧光定量PCR检测HCV NAT+: 1/8805（ALT 390U/L）；HBV NAT+: 抗-HBc阳性中：1/946；单项抗-HBc阳性中：5/495（1）文献24 厦门血液中心自行设计引物，HCV50人份混合，NucliSensExtractor 提取核酸，NASBA技术，混扩增，ECL 检测 2/10000,即 15000文献25江苏省血液中心华美HCV RNA试剂盒单人份，PCR,电泳 2/750，即1375文献26 上海血液中心美国Ch
14、iron Procleix HIV-1/HCV8人份或24 人份混合；TMA技术；化学发光检测 0103539;文献7 北京血液中心匹基HCV/HIV-1 荧光PCR核酸检测试剂24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR 0/34373; 0/34373文献27多单位参加的国际合作美国Chiron Procleix HIV/HCV16 人份混合；无菌采血管EDTA抗凝，TEAN自动混样；2 /80259 （其中1个ALT 254 IU/ml） HIV NAT +：0/80259文献28深圳血液中心Roche Ampliscreen HBV/HCV/HIV24人份混合，
15、STAR2000自动混样;Roche MPLC自动提取 核酸；Roche COBAS Amplicor 扩增和检测 0/16512; HIV NAT+: HBV NAT+: 8/16512,即1/2064文献29及个人交流（深圳血液中心,王良华，2005年月）沈阳血液中心匹基HCV 荧光PCR核酸检测试剂 0/8.3万个人交流（沈阳血液中心，李剑平博士，2005年6月）中山中心血站及芜湖中心血站厦门长城，无锡三星，上海正业 HCV PCR 77/28098（1/365）文献30表4国内原料浆开展NAT检测研究情况中国药品生物制品检定所 0/19196; 0/19196文献31上海莱士血制品有限
16、公司匹基HBV/HCV/HIV-1 荧光PCR核酸检测试剂48人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR 1/1401718 （1/140万）; 31/1401718 （ 1/4.5万） ; 3/1250007 （1/41.7万）文献32Chiron Procleix HCV/HIV-1 Assay16人份混合，TMA技术；HCV NAT+ : 1/10032; 0/10032个人交流（检定所，白坚石博士，2005年1月） 3.3.2 我国核酸筛查技术应用工作小结：1）NAT检出率：有限的研究数据表明，我国献血者血液NAT检出 率HCVNAT+检出率结果差异很大，从1/3
17、65（国产试剂,电泳）1/4.0万0/10.4不等； HIV NAT+检出率 0/10.4万；HBV NAT+为 1/946（anti-HBc+ 献血者中） 1/2088。我国原料浆NAT检出率： 1/1.0万1/4.5万; HIV NAT+： 1/41.7万； 1/140万（48人份混合）。2）必须重视核酸检测的质量控制体系： 注重避免交叉污染： 检测方法：传统的电泳检测为开放式，不适合； 严格的核酸检测实验室设置和管理。 注重试剂质量：为适应血液混样检测对灵敏度的要求，一些国产血筛试剂在临床诊断试剂的基础上已做样品处理的改良，灵敏度（如匹基）在考察期间不错。但仍有待完善，表现在： 灵敏度、
18、重复性、特异性：进口NAT血筛试剂质量稳定，各批质量波动小；国产试剂批间差异问题；特异性问题。 内标：进口试剂每个检测管均有内标，保证阴性结果的可靠性；国产试剂由于尚无法解决加入内标后灵敏度降低的问题，未加内标，因此存在假阴性问题。 自动化：进口试剂已有配套的检测系统和软件，便于大规模筛查；国产试剂尚在起步阶段，尚不能实现自动化，没有配套软件。 标本留样和处理：也是核酸检测质量控制体系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已降解，造成假阴性检测结果。根据我们的研究结果，用于NAT检测的标本应用无菌留样管采集。4. 血液核酸筛查发展趋势4.1 NAT检测先从原料浆开始实施，再在献血者中实施:NAT
19、血液筛检方法总是从血浆制品的原料浆的筛检开始的,积累了充分的经验后,才逐步应用到血站的采供血系统。例如, 日本从97年11月起在原料浆中进行NAT筛检，1999年7月在东京都试用于献血者中33；欧洲医疗产品规范委员会（CPMP）规定从1999年7月起所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行HCVPCR检测,当时NAT只在少数血站进行评估,而大部分血站供血系统至今仍未进行NAT筛检; 美国早在1994年FDA就曾提出血浆蛋白生产的原料浆必须进行NAT筛检,而血站系统则从1999年才开始全面进行NAT的可行性评估34。4.2自动化，集中化检测 以地域为单位建立几个大型的集中式的NAT血筛中
20、心,既便于质量管理,又能节省检测成本。例如,全日本只设3家NAT检测中心,分区域对77家血液中心的标本进行HCV、HBV、HIV核酸检测和分析35。又如美国红十字会（ARC）在全美成立了3个NAT检测中心,每天将所有ARC血站采集的血液集中到这3个检测中心进行NAT检测,据测算,尽管血液标本的冷链运输消耗一部分费用,但集中检测的成本仍低于各个血站单独检测。我国香港地区将血液标本送到澳大利亚进行NAT检测也是这个道理。目前,欧洲各国的血站正在进行或已经完成整合,也正是顺应了集中化管理的潮流。4.3 混合样本数逐渐减少为降低成本,在保证灵敏度的前提下,NAT往往将一定数量的血液标本混合起来检测。N
21、AT检测最初在欧洲普遍流行96人份样本混合检测,随后逐渐更换成48人份,直至目前的24人份混合。TMA刚开始在美国ARC进行评估时,将128份血液标本混合起来检测,随后改成16人份混合34。日本1999年7月起用于献血者筛查，2000年2月起由原来的500份混合检测改为50份混合检测33；新加坡从一开始就使用单人份血液标本进行NAT检测。这样更改的原因一是可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检,二是混合样品增多,一旦发现阳性检测结果,进一步拆分混合样品,最终找到阳性血液标本的工作变得复杂耗时,有时还会影响正常的血液供应。4.4 应考虑考虑成本效益比NAT对提高血液安全确实有帮助，从各国公布的NAT
22、检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一,虽然从经济学角度考虑,为了保障每年如此少数几个人的安全而投入大量的人、财、物进行NAT血液筛检,不太经济,然而对于受血者来说,一旦输入感染病毒的血液,被感染的概率就是100%。因此大多数国家从人权角度考虑,仍然在经济允许的条件下开展NAT血液筛检；但成本-效益的问题也是各国家所关心的36-39。4.5一些国家已在考虑加做HBV NATChiron 已开发Ultrio，可同时检测三项，初步临床试验数据表明，HBV NAT的检出率较高：在新西兰：检出HBV NAT+： 1/1991，单人份检测； 新加坡： 1/6000，单人份检测。而在国内，尽管由于混合检测使HBVNAT的窗口期加长，HBV NAT+检出率仍比较高，为1/946（anti-HBc+ 献血者中） 1/208825,29。 因此，如果在国内开展NAT临床服务工作，应考虑加做HBV NAT。
