1、1目的32范围依据4职责权限5验证方法5.2验证内容和结果3 85.3验证结论96附件10-12R2A培养基适用性验证报告1目的因2015版药典纯化水检验用培养基变更，依1105非无菌产品 微生物限度检查 方法，通过此次实验对所更换的R2A琼脂培养基进行适用性检查，以证明该方法 及所采用的培养基适用于纯化水微生物限度检查日常检测。2范围适用于本公司纯化水的微生物限度检查。3.依据中华人民共和国药典（2015年版）4.职责权限部门分工职责组长：组织确认或验证工作，批准方案和报告负责编制方案、实施、总结报告及微生物检测负责设备样品提供，配合实施方案的工作负责微生物检测5.验证方法5.1R2A培养基
2、的适用性检查5.1.1R2A培养基应进行培养基的适用性检查。5.1.2菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代，试验用菌种应采用适宜的菌种 保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。5.1.3菌液制备铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的微生物培养基质控品，使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后，在漩涡混合器上振荡混匀，制成1ml（相当于10100cfu/0.1ml）菌悬液。5.1.4适用性检查 取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各10100cfu，分别注入无菌 平皿中，立即倾注R2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固， 置3035C培养不少于5天，计数；5.1.5结果判定 被检定的固体培养基上
3、的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.52范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。 判该培养基的适用性检查符合规定。5.1.6实验前的准备5.161仪器设备设备名称设备编号设备状态压力蒸汽火菌器10-11-53未检定 己检定在有效期内激光尘埃粒子计数器Y09-3016温湿度计JWS-A3微压差表B10093624B10090070细菌培养箱SPX-100B-Z霉菌培养箱MLX-150-1确认人： 日期：5.1.6.2操作环境微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气 区域、
4、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证5.163器具 无菌培养皿：（直径90mm） 1ml注射器5.2计数方法的验证5.2.1当建立纯化水微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法 的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验 证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列 要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查5.2.2验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试
5、验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。（1）试验组薄膜过滤法计数时，取1ml纯化水，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入10100cfu试验菌，过滤，滤膜置于R2A琼脂培养基上。（2）菌液组 将相当于10100cfu/ml菌悬液置于100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白 胨缓冲液过滤。（3） 供试品对照组 取1ml纯化水供试液置于100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液，过滤，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。5.2.3结果判断 在3次独立的平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落 的值与菌液对照组菌落数的比值应在 0.52范围内。5.2.4.试验样品 5.2.4.1纯化水5.2
6、42稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.243器具 无菌培养皿：（直径90mm ） 一次性注射器5.244验证用微生物名称及其编号菌株名称编号铜绿假单胞菌CMCC（B） 10 104枯草芽孢杆菌CMCC（ B） 63 5015.2.4.5培养基名称生产商培养基批号有效期琼脂培养基（R2A琼脂）青岛尼赛欣合生物技术有限公司20151009201810085.2.5验证试验操作5.2.5.1试验菌的制备和稀释铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的微生物培养基质控品 ，使用前注入1.1ml稀释液 充分溶解后，在漩涡混合器上振荡混匀 制成1ml（相当于10100cfu/0.1ml）菌悬 液.再用
7、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将其稀释制成10100cfu/ml的菌悬 液。5.2.5.2将试验分为3组A样品试验组 取纯化水1ml，置于装有PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇 1分钟。每张滤膜抽滤100ml的供 试液用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗滤膜，最后加入10100cfu 试验菌，每株试验菌平行制备2个平皿，按膜过滤法测定其菌数。B菌液组 将10-100cfu/ml菌悬液置于装有100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇 1分钟。每张滤膜抽滤100ml的供试液通过一张滤膜，平行制备两个
8、以测定所加的菌数。C供试品对照组 取纯化水1ml，置于装有PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲 液100ml的三角烧瓶中或均质袋中，充分振摇 1分钟。每张滤膜抽滤100ml的 供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗滤膜，平行制备2个平皿, 按膜过滤法计数测定供试品的本底菌数。525.3培养枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在 3035 C下培养不少于5天，将点 计菌落数。并将结果记录于附件。526试验结果试验组的菌的回收率接入菌种菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组平均值枯草芽抱杆菌表中：回收率=（试验组的平均菌落数一供试品对照组的平均菌落数的值）十菌液组的平均菌落数X100%5.3验证结论531计数性培养基适用性检查结论：试验组菌落数减去供试品对照组菌落的值 与菌液对照组菌落数的比值应在0.5 2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基 上的菌落一致。判定R2A琼脂培养基的适用性检查符合规定。 可用于本公司纯化水微生物限度检查实验。5.3.2校正因子（修正系数）校正因子=1/回收率菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）菌液组的微生物生长检查记录菌液组计数结果（cfu/皿）供试品对照组的微生物生长检查记录供试品供试品对照组计数结果（cfu/皿）测试人/测试日期： 复核人/复核日期:批号： 产品试验组的微生物生长检查记录:测试人/测试日期:复核人/复核日期:
