1、12.转染：病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程。由于噬菌体是细菌的病毒，因此噬菌体DNA 导入大肠杆菌的感受态细胞也称转染。13.转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程14.启动子：是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，是RNA聚合酶与模板DNA结合的部位。内含保守序列。当启动子与全酶结合后开始转录。15.起始密码子：mRNA上的碱基顺序每3个碱基用解读框架划分开，可决定其所生成蛋白质的氨基酸顺序，为了使碱基顺序作为遗传信息能正确转译，通常需要从某个特定的位置开始转译，这个起始点的密码子就叫做起始密码子。16.终止子：位于一个基因编码
2、区3下游提供终止信号的DNA序列，可以被RNA聚合酶识别并发出停止mRNA合成的信号。一般为一段发卡结构的反向重复序列。 17.粘性末端：是指DNA分子在限制酶切割后产生一条链多出几个碱基的互补对称的突出末端，若5突出称5粘性末端，他们能够通过碱基间的配对而重新环化起来，若平末端的DNA片段则不易重新环化。18、终止密码子：有三个密码子（UAA, UAG，UGA），是使蛋白质合成终止的码子，通过一个或两个组合在一起发挥作用。只表示链的终止，不表达氨基酸。19.锌指结构：由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，并以锌辅基螯合成的环状结构作为活性单位，在指状
3、突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。20.载体（vector）：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。主要包括五类：质粒，噬菌体的衍生物（柯斯质粒，单链DNA噬菌体M13）、动物病毒。21.PCR.：聚合酶链反应，是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件：模板DNA，寡链核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使加入的4种dNTP由引物沿模板从53按碱基配对原则, 形成与模板DNA互补的半
4、保留复制链。23.Genomic DNA：即基因组DNA，指组成生物基因组的所有DNA，包含一个生物体的全部遗传信息，即DNA的全部核苷酸序列。24、Intron：即间隔子（内含子），在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。内含子对翻译产物的结构无意义，它比外显子累积有更多的突变。25、Exon：指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。是真核生物基因的一部分，它在剪接（Splicing）后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列, 又称表达序列。既存在于最初的转录
5、产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。27.转录（transcription）：生物体以DNA为模板在mRNA聚合酶的作用下，合成RNA的过程称为转录。包括转录起始、延伸、终止等过程。转录是不对称的，体现为在DNA双链上一股链可以转录而另一股不可以。二是模板链并不都是在同一单链上。 28.翻译（translation）：在多种因子辅助下，细胞内以mRNA为模板，在核糖体上通过以tRNA识别mRNA的三联体密码子和转移相应氨基酸，组装合成蛋白质肽链的过程。29.顺式作用元件：顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,主要位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起
6、始位点和RNA聚合酶的转录效应。按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子、终止子等DNA序列片段。30.反式作用因子：反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的核内非组蛋白，激活或阻遏基因表达。31.transcription factor：即转录因子，能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。32.瞬时表达：外源基因进入宿主细胞后，不整合到受体细胞染色体而独立于其外，随复制而出现基因产物，但复制量不宜太多，否则会引起细胞死亡，也不能随细胞传代，因而其表达的量越来
7、越少最后消失。这种现象称为瞬时表达。33.稳定表达：（1）外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 （2）基因工程表达系统中工程菌株或细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定的现象。34.亮氨酸拉链：出现在DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元。当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链35.基因突变：是基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变（通常它只涉及基因中部分序列的变化），并引起个体表型的改变, 而使生物体发生遗传性变异。36.无义突变：是指由于某个碱基的改变使代表
8、某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。37.错义突变：是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。38.同义突变：碱基被替换之后,产生了新的密码子，但由于生物的遗传密码子存在简并现象,新旧密码子仍是同义密码子，所编码的氨基酸种类保持不变。39.限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化出来。40.基因拼接：将有共同限制性内切酶切点的基因连接起来形成多种基因杂合体，如将IFN- 1与IFN- 2亚型间进行拼接，可形成IF
9、N- 1/ 2或IFN- 2/ 1等。41.基因缺失：有时为了提高表达效率及降低一些毒性作用，将原基因中的非功能区域的编码子人为地使之缺失的过程称为基因缺失。42、重组病毒载体：将外源性的DNA直接插入缺陷型的病毒基因组上，插入的外源片段的大小同被取代的病毒基因组区段是等同的。这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，使用的病毒为病毒载体。43.重组质粒型载体：即重组病毒-质粒载体，这类载体只取病毒基因组中维持在哺乳动物中进行复制的有关序列以及抗性标记基因，使它与一个细菌质粒融合，这样的重组体也能够在大肠杆菌中进行复制和增殖。44.基因工程多肽疫苗：使微生物对人体具保护作用的抗原基
10、因经体外重组表达后所制备的生物活性多肽类疫苗称基因工程多肽或亚单位疫苗。45.基因置换（gene replacement）：指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。46.基因修正（gene correction）：指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。47.基因修饰（gene augmentation）：指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。48.基因失活（gene inactivation）：应用反义技术特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某
11、些有害基因的表达49.转基因动物：就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物的子宫内, 使之发育成具表达目的基因的胚胎动物, 并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。50.动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与
12、细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。51.基因敲除：是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术。52.ES细胞：胚胎干细胞，不仅具有全能分化能力，而且可以在体外培养建立细胞株。同时还有无限增殖和自我更新等功能。53.基因：是控制生物性状的基本遗传单位，是遗传变异的主要物质，支持着生命的基本构造和性能。二问答题1.什么叫基因？何谓基因的新概念？其主要功能是什么？答：基因就是指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因、断裂基因、重叠基因、假基因等
13、基因的新概念。功能：编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位 是构成DNA的功能单位。2.真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？不能，真核细胞基因序列中的内含子是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随DNA 转录参与形成前体mRNA，而后剪切掉，在原核细胞中不包括这类内含子，也缺乏相应加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化RNA的合成。3.试述DNA分子的结构及其意义。DNA一级结构：即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序
14、。意义：1、蕴藏遗传信息；2、决定着DNA的空间结构及基因间相互作用和调控功能。DNA二级结构：为DNA双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成。形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。DNA三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括超螺旋、多重螺旋等。1、使DNA体积更小，2、超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。三链DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。1、作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响DNA 与蛋白质结合及DNA复制转录等。四链DNA：如端粒酶是真核细
15、胞DNA 3末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。4.试述cDNA文库的构建过程及其意义。过程：1、cDNA克隆：提取总RNA，用亲和层析法获取较纯的mRNA。2、第一股 cDNA合成：以分离纯化的mRNA为模板， 在引物与反转录酶的作用下，沿模板的35方向合成。3、第二股cDNA的合成： 自身引导法 置换合成法 外加引物合成法 4、cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组DNA。1、 cDNA无内含子，大大减小其长度，便于操作。2、减少了筛选目的基因的工作量。3、利于获得较多模板。4、可直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质
16、和功能。5、基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白。5.试述基因组文库的构建过程及其意义。：（1）分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA；（2）制备全部基因组的DNA片断。（3）构建基因组文库载体（4）DNA片段与载体的连接包装（5）导入细胞，可用质粒或者噬菌体（1）可便于研究基因组中5末端控制基因转录的调控序列，内含子的分布和作用以及重复序列的数量及分布的大小。（2）开展“人类基因组计划”研究。3、在哺乳动物细胞中，是表达目的蛋白的基本形式之一。6.什么是限制性核酸内切酶？限制性核酸内切酶是一类可以识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类限制酶。主
17、要从原核生物中分离纯化而来。根据限制酶的结构,辅因子的作用方式，可将限制酶分为三种类型：I型、II型及III型。型既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型只催化非甲基化的DNA的水解；III型同时具有修饰及认知切割的作用。7.试述双脱氧末端终止DNA测序法的原理及过程。原理：将2 ，3双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸, 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, dd
18、ATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了。8.试绘图并说明大引物PCR定点诱变法的过程。以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的引物。第一轮以引物2和引物3扩增出短片段DNA，引物2含有预先设计的突变序列。待PCR产物经纯化后除去原来的引物，然后以上一轮PCR扩增产物作为大引物，并与引物1一起再对靶基因作第二轮PCR扩增，其产物即为突变的DNA。9.何谓基
19、因工程的四大里程碑和三大技术发明？四大里程碑：1、肺炎球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，而且还证明了DNA可以转移，并把一个细胞的性状传递给另一个细胞；2、DNA双螺旋结构，建立了DNA半保留复制及蛋白质合成的中心法则，提出了遗传信息是DNARNA蛋白质，也阐明了转录翻译过程中出现误差造成生物变异；3、遗传密码子的破译：提出操纵子学说，到完全破译64个遗传密码子，确定遗传信息是以密码子方式传递的；4、基因转移载体的发现：20世纪60年代，发现了细菌的质粒，它是指生物体染色体以外的环状DNA，具有独立自我复制的能力，可在微生物细胞间转移。三大技术发明：工具酶的发明（内切酶、合成酶、
20、连接酶）；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。10.基因工程常用的载体有哪些？其共同特性如何？常用载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒；共同特征：自主复制易于扩增分离纯化有非必需区有单一酶切位点有选择标记基因表达载体还应有表达调控元件11.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？作为理想的质粒载体 应具备以下几个条件1、能自主复制，即本身是复制子2、具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能（3）在基因组中有1-2个筛选标记 为寄主细胞提供易于检测的表型特征（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。12.什么叫插入
21、失活，举例说明之？外源基因片段克隆到插入型载体上后，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应，也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌 -半乳糖甘酶失活。例一：免疫功能失活。Imm434是噬菌体434的免疫区段，通过噬菌体杂交的办法导入 噬菌体基因组，构成插入型的派生载体。在C基因内部有EcoR和Hind的单一切割位点，若在这两个位点中任意一个插入外源DNA片段，都会导致C基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，进入溶菌周期，结果产生出清晰的噬菌斑，而亲本噬菌体C未失活，可以变成溶原的状态，形成浑浊的噬菌斑。13.如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？1、抗生素抗性标记筛选
22、：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，如抗氨苄西林基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，而未被转化的原宿主菌则不能生长。2、抗性基因的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌株。14.如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？1、利用遗传标志的表型特征筛选：（1）由载体提供的性状进行筛选：a、抗生素抗性标记筛选：当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，
23、所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌，能在含相应抗生素的平板上生长形成菌落，而未转化的原宿主菌则不能生长。b、抗性基因的插入失活筛选：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致抗性基因功能失活，用两个含不同抗生素的平板进行对照筛选。c、 -半乳糖甘酶LacZ基因失活：通过基因内互补作用，使缺失LacZ基因的突变体和带有完整LacI而无 -半乳糖甘酶活性的的突变体结合，形成有功能活性的 -半乳糖甘酶。（2）根据插入基因的遗传性状进行筛选：如亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必须，如果外源基因中能够表达Leu，则可使细菌生长。2、根据重组子的
24、结构特征筛选：（1）重组子大小鉴别筛选：携带外源目的基因的重组子质粒分量大，条带滞后，反之在前。（2）酶切鉴定：原载体无外源目的片段，电泳为一条带，装有外源基因的载体有原载体和目的基因片段两条带。（3）PCR筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子DNA为模板扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子，还可进行直接测序。（4）原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA变性和用特异探针进行杂交。（5）斑点杂交：将重组体DNA或RNA提取出来，将样品点在硝酸纤维膜上进行杂交。纯化的重组体去除了杂质干扰。（6）S
25、outhern blot：将同源片段定位在某个酶切片段中，可用于对克隆后片段的基因定位，也可测其含量。15.质粒单酶切点的基因连接缺点及如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？一般用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶，预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5-P基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种DNA分子的每一个连接位点中，载体DNA都只有一条链是外源DNA连接上的，而另外一条链由于失去了5-P基团，不能作此连接，故留下一个具有3-OH和5-OH的缺口。另外，也可改用双酶切片段的定向克隆，用两个不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，产生
26、两个不同的粘性末端，避免该现象。16.真核表达调控的顺式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。作用特点：1、多数位于真核生物结构基因上游，只有终止子位于下游，而增强子可以在上游也可以在下游。2、能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的DNA片段。3、决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。反式作用因子因子：通用转录因子和转录调节因子。1、同一DNA序列可被不同蛋白质识别。2、不同蛋白质因子可与不同DNA 序列发生联系，但直接连接为少数。3、蛋白质-蛋白质或DNA-蛋白质的结合，均导致构象上得细微变化，构象变化常是实现调控功能的分
27、子基础。4、在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。17.目的基因表达系统有哪几种？其特点如何？主要有原核和真核两大表达系统。两个系统的特点：1、真核生物DNA大部分是非裸露的，由核膜包裹，原核生物大部分DNA属于非结合状态，又无核膜相隔。2、真核生物DNA 中存在内含子，原核生物DNA序列中没有内含子。3、真核生物具有在需要时以可控方式重拍某些DNA片段和扩增特定基因的机制，原核生物中罕见。4、真核生物有3种不同的RNA聚合酶，而原核生物往往只有一种。5、真核生物产生的mRNA分子寿命大多比原核生物长。6、真核生物初级转录产物可进行转录后的加工修饰。7、真核生物不存在操
28、纵子结构，转录产物mRNA为单顺反子。原核基因表达调控顺序为操纵子，转录产物为多顺反子 8、真核生物基因为多拷贝。而原核生物中除了rRNA，tRNA和启动子部分区域为重复序列，其余基因很少含重复序列。9、真核生物一条mRNA上同时只能合成一条肽链，原核生物每个核糖体可独立合成一条肽链。 10、真核生物翻译过程不需要SD序列的特异性结合，原核生物必须依赖这种序列。11、原核生物表达的外源基因蛋白产物不能被糖基化。18.基因工程疫苗研究开发常用的途径是什么？19.基因治疗展望和应用如何？展望：基因治疗存在感染率低，表达水平低，长期表达效果难，整合随机性带来危害等自身问题，以及伦理道德，安全性，技术复杂，要求条件高，所用细胞寿命短等技术问题。但它是人类治疗疑难疾病的新方法，新技术，随着研究和应用的不断发展，不断深入，技术不断完善成熟，基因治疗将会在人类常见病和多发病及疑难病的有效治疗中发挥巨大作用，许多原来视为“不治之症”的疾病将应用这先进技术得到治愈，其应用前景极为广阔。应用：1、遗传性疾病的基因治疗 2、肿瘤的基因治疗（1）抑癌基因转移的基因治疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗（5）多重耐
