1、这些工作对提高HIV-1病毒载量的检测技术，保证质量起到了重要作用。为了进一步规范艾滋病实验室HIV-1病毒载量检测，建立标准化质量控制程序，准确开展各项检测及质量控制工作，特制定本指南。本指南是根据各种HIV-1病毒载量检测方法的技术要求，结合现行的国内外相关技术规范而制定。本指南针对HIV-1病毒载量检测的实验室设置、样品管理、检测技术、质量控制、生物安全等方面提出指导。本指南自20XX年初正式开始编写，性病艾滋病预防控制中心多次组织了有国内外专家参加的指南编写专项技术咨询会，与会专家对指南提出了很多建设性意见和建议，美国NIH病毒载量检测质量保证实验室专家多次对指南进行认真的审阅和具体指
2、导。指南编写过程中，也认真听取了实验室一线检测人员的具体需求和建议，并补充了大量的实验数据，包括HIV-1病毒载量检测值的稳定性、冻融影响实验与不同检测方法之间比较的实验数据等。在此基础上，经过多次修订、补充和审定，于20XX年11月完成HIV-1病毒载量检测及质量保证指南的最后定稿。由于国内外还没有可作为参考的HIV-1病毒载量检测及质量控制的相关指南，因此本指南主要提出一些原则上的参考建议，其中定有不妥之处，希望广大同仁提出意见，以便不断完善。致 谢在本指南的编写过程中，世界卫生组织、克林顿基金中国艾滋病防治项目和美国NIH等国际组织与机构给予了大力支持，全国HIV-1病毒载量检测实验室一
3、线操作人员提出了许多建设性的意见和具体需求，艾滋病参比实验室工作人员毛玮、陶晓霞进行了大量的补充实验和文字编辑工作，才保证本指南的编写顺利完成，在此一并向他们表示真诚的感谢。中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心主任吴尊友研究员在本指南编写过程中提出了重要的修改意见，在此特别致谢。HIV-1病毒载量检测及质量保证指南（20XX版）第一章 总则第二章 第三章 实验室设置第四章 第五章 样品的采集、处理、保存、运输第六章 第七章 常用HIV-1病毒载量检测方法简介第八章 第九章 室内质量控制第一十章 第一十一章 外部质量控制第一十二章 第一十三章 实验室生物安全第一十四章 附表1 常见问题分析
4、和处理附表2 HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单附表3 HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单附表4 HIV-1病毒载量检测报告单附表5 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（NASBA）附表6 HIV-1病毒载量能力验证结果专用报告单（RT-PCR）参考文献缩略语第一章 总 则1.1意义 HIV-1病毒载量是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。检测HIV-1病毒载量可以监控和预测病程，指导艾滋病患者的抗病毒治疗，包括确定治疗时机、选择治疗方案、评价治疗效果；结合疾病临床症状和其它实验指标，可作为早期感染诊断的辅助手段；还可用于婴儿早期感染的辅助诊断以及采供血机构样品的窗口
5、期检测。为了准确地检测HIV-1病毒载量，必须对开展HIV-1病毒载量检测的实验室进行规范化管理和质量控制，才能保证检测结果的准确性和可靠性。1.2目的 指导HIV-1病毒载量检测工作，规范实验室质量控制与管理。1.3适用范围 适用于我国开展HIV-1病毒载量检测工作的所有实验室。第二章 实验室设置各种HIV-1病毒载量检测方法需要相应的辅助设备才能完成检测。以下为HIV-1病毒载量检测实验室不同分区内必备的辅助设备及耗材。2.1样品处理区：2.1.1生物安全柜：二级2.1.2离心机（320XXg，可离心1.5mL 管子）2.1.3冰箱：4，-20，-802.1.4水浴箱：准确度小于0.52.
6、1.5加样器1套（20L、200L、1000L），为专用设备2.1.6有滤芯的一次性吸头（无DNA和RNA酶）2.1.7计时器2.1.8旋涡振荡器：震动频率可调2.1.9 一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.2试剂准备区：2.2.1超净工作台（或密闭工作台）2.2.2加样器1套（20L、200L、1000L），为专用设备2.2.3离心机（18000g，可离心1.5mL 管子）2.2.4冰箱：4，-202.2.5 计时器2.2.6旋涡振荡器，震动频率可调2.2.7有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）2.2.8 1.5mL 管子（无DNA和RNA酶）和1.5mL 试管架2.2.9一次性工
7、作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.3扩增产物分析区：2.3.1 HIV-1病毒载量检测仪2.3.2加样器1套（20L、200L、1000L）2.3.3冰箱：2.3.4水浴箱 （ 41 ）2.3.5旋涡振荡器：2.3.6有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）2.3.7一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.4 HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪,加样器离心机冰箱-20，4水浴箱洗手池紫外灯扩增产物分析区生物安全柜加样器冰箱-80，-20冰箱样品处理区超净工作台加样器漩涡振荡器实验台试剂准备区2.4.1总体原则：各区独立、控制风向、因
8、地制宜、方便工作。具体来说： 2.4.1.1各区必须是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分隔开。2.4.1.2各区的仪器设备以及各种物品必须是专用的。2.4.1.3 试剂准备区和样品处理区可保持低度正压（或常压）状态，使空气流向始终由室内向外，以避免扩增污染物进入此区域。2.4.1.4 扩增产物分析区可保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向内，以防止扩增产物造成其他区域的交叉污染。可安装排风扇或其他排风装置。2.4.1.5扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。2.4.1.6工作时必须遵循单一工作流向进行，即工作流向只能从试剂准备区开始，到样品处理区，然后再
9、到扩增产物分析区。第三章 样品的采集、处理、保存和运输 样品采集、处理、保存和运输，按照所使用检测方法的要求严格执行。用于HIV-1病毒载量检测的样品推荐采用抗凝血浆。3.1 样品的采集3.1.1 采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。3.1.2 3.1.3 抗凝剂： 通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸橼酸钠） ，并符合不同检测方法对样品的要求。3.1.4 3.1.5 样品标识：在采血管上贴对应的样品编号，并填写HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）。3.1.6 3.1.7 样品采集量：通常采集全血35ml, 采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过
10、多或不足，会造成血液凝固或被稀释。3.1.8 3.1.9 样品的混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次，使血液与抗凝剂充分混匀。3.1.10 3.1.11 获取其它信息：包括采集对象的基本信息和流行病学资料，抗病毒药物使用情况，以往的实验室检测结果，在HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）上备注栏注明。3.1.12 3.2 样品的处理3.2.1 一般要求在采血后6小时内进行离心，室温下800-1200Gg离心10分钟。3.2.2 分离后，吸出血浆，分装到无菌的聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间。在冻存管上贴样品编号。3.2.3 血浆样品不能灭活。3.2.4 做好样品处理记录
11、。3.3 样品的保存3.3.1保存条件：根据血浆检测时间而定，4天内可在4暂时保存，3个月以内应冻存于-20以下，3个月以上应置于-70以下。不推荐使用自动除霜冰箱。3.3.2血浆样品冻融不应超过3次。3.3.3监控并记录保存温度以及样品状态的变化。3.3.4防止样品变质、泄漏及污染。3.4 样品的运输根据可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，防止样品冻融。3.5 样品的发送和接收3.5.1发送样品时必须填写样品HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）。3.5.2接收样品时，核对样品数量，检查样品状况，按HIV-1病毒载量检测样
12、品送检及接收单（附表2）核对。3.5.3 样品管破损造成样品溢出、出现明显溶血、凝血的样品，不宜作HIV-1病毒载量检测；如果样品已经融化， 4保存并尽快检测，记录冻融一次。第四章 常用HIV-1病毒载量检测方法简介目前常用的HIV RNA测定方法为核酸序列依赖性扩增（NASBA） 技术，代表产品为NucliSens ECL 及其升级产品荧光实时PCR技术NucliSens EasyQ仪；逆转录PCR系统（RT-PCR）技术，代表产品为AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay；分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术，代表产品为bDNA 340分析仪；实时荧光定量PCR扩增技术（
13、real-time PCR），M20XX与国产试剂盒均属此类技术。41 核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术最早产品为NucliSens ECL定量RNA测定方法，最近被NucliSens EasyQ新一代荧光实时定量PCR所取代。NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。此方法可分成四个步骤：核酸释放、提取、扩增和测定。扩增后的产物使用NASBA QR电化学发光（ECL）系统进行检测和定量，此系统包括亲和素标记的磁珠、生物素标记的核苷酸片段（此片段可与新合成的RNA产物的一端互补结
14、合）及可特异与四种产物结合的探针（探针上标记有铷元素），这四种探针可分别与不同的RNA产物结合。将四种探针分别置于不同的反应管内，在适当的条件下（410C）几种成分将结合在一起，形成复合体。这些复合体可在ECL读数仪中被分别读取铷元素的激发信号，根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。Nuclisens EasyQ 结合NASBA（核酸序列基础分析）技术与分子荧光探针技术（Molecular Beacon）检测血浆中的HIV RNA水平。这种结合的方法使用了实时扩增分析（real-time amplification assay），提高了对诊断质量的要求。
15、42 逆转录PCR系统技术目前用得最广泛的仪器为COBAS AMPLICOR和相应的检测试剂COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM 1.5版。聚合酶链反应人类免疫缺陷病毒HIV-1定量检测试剂盒1.5版是在聚合酶链反应全自动诊断仪上定量测定人血浆中人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）RNA水平的体外核酸扩增检测试剂盒。该检测试剂盒可以通过两种样品处理程序进行检测，即标准的和超敏感的操作步骤，定量测定含量为50-750,000拷贝/毫升 HIV-1 RNA。标准的样品处理程序中，HIV-1 RNA通过应用裂解液裂解病毒颗粒从而直接从血浆中分离出来，然后用乙醇沉淀RNA。采用超
16、敏感的制备方法，血浆中HIV-1病毒颗粒首先通过高速离心浓缩，然后用裂解试剂裂解病毒颗粒。再用乙醇沉淀RNA。COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM试剂盒1.5版包括5个主要步骤：试剂准备；样品制备；靶RNA的逆转录产生cDNA；用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增；通过比色与探针结合的扩增产物的测定。HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括作为HIV-1 靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增子单一探针结合区的非感染性RNA 转录物。将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个样品中和HIV-1靶序列一起共
17、同进行样品制备、逆转录、PCR扩增、杂交和检测并和HIV-1靶序列一起扩增。COBAS AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的数据计算每一个样品的HIV-1 RNA的含量。该定量标准品补偿了抑制因素的影响并且扩增过程的质控使每一个样品的HIV1 RNA得以准确定量。43 分枝DNA（bDNA）技术分枝DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分枝DNA信号放大系统，这是一个人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记
18、样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。每一种bDNA检测都有各自的步骤或试剂。bDNA检测通常包括以下步骤：（1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加到微孔中；（2）孵育。此步骤可释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性, 然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷却洗板；（4）加信号放大探针（bDNA）到各孔内；（5）孵育. 此步骤使bDNA杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，此步骤使酶标记的探针杂交到bDNA上；（9）冷却洗板；（10）加化学发光底物到各孔中；（11）孵育，此步骤让酶和底物相互作用，产生化学
19、发光信号。发射的光强以相对光量值（RLUs）表示。产生的光强直接与各样品中病毒RNA或DNA的载量成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。44 实时（real-time）荧光定量PCR扩增实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可
20、从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR扩增的实验检测过程可分为：（1）样品制备,抽提和浓缩目标RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）扩增产物的检测，基于检测阈值的设定，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量检
21、测。第五章 室内质量控制内部质量控制是在良好实验室整体环境支持下，从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）检测过程（试剂、操作过程，质控品使用）；（5）数据。5.1人员HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。5.1.1 所有相关检验人员需经操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。5.1.2复核人、签发人应具备对检测过程进行分析、解决问题的能力。5.2实验室分区和环境5.2.1实验室分区的功能HIV-1病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。
22、不同检测方法的分区功能和要求可有所不同。5.2.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存；5.2.1.2 样品处理区：样品登记、分装，核酸提取、保存和加样；5.2.1.3 扩增产物分析区：产物扩增的测定、结果分析、登记及报告。严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。实验室的设置及辅助设备的具体要求参见第二章。5.2.2 实验室环境的要求5.2.2.1实验室有足够的空间；5.2.2.2采光好，应避免阳光直射设备；5.2.2.3室温控制在1825；5.2.2.4室内相对湿度控制在5070%；5.2.2.5电源稳定，HIV-1病毒载量检测仪应配备稳
23、压电源；5.2.2.6室内保持干净整洁，无灰尘。5.2.2.7实验前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸钠及时处理操作台面。5.3 仪器设备质控5.3.1加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次。每季度期间核查一次。5.3.2 HIV-1病毒载量检测仪、离心机可以委托公司校准，每年一次。5.3.3冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。5.4检测过程质控 5.4.1试剂质控5.4.1.1 所有试剂盒须严格按要求条件保存。5.4.1.2试剂盒拆封时，要记录拆封时间，所有试剂严格控制在有效期内使用。5.4.1.3使用经中国食品药品监督管理局注册的试剂。5.4.2 实验用水：要求使用无DN
24、A和RNA酶的水。5.4.3 操作过程质控严格执行仪器和试剂的标准操作程序（SOP），不得擅自修改。5.4.4质控品的使用每次实验需同时使用试剂盒内的质控品以及一个HIV-1 RNA为5000-15000拷贝/毫升的外部质控品。5.4.4.1外部质控品的制备按实际使用量的要求配制大样品量的血浆（推荐每次配置量可使用两年），用0.2m滤膜过滤除菌，充分混匀。用无菌冻存管定量分装，标记，封口，冻存于-80以下非自动除霜冰箱内。5.4.4.2外部质控品的定值随机选出10管外部质控品，按照实验室的检测条件进行HIV-1病毒载量检测，将拷贝值换算成Log10值，计算算术平均值（m）和标准偏差（s）。5.
25、4.4.3质控图的绘制和使用根据外部质控品的定值，绘制质控图。在质控图上显示所有10次质控品检测值的Log10值、平均值以及1.5s 值范围。每次检测都应带1个外部对照，将得到的外部对照Log10值标在质控图上，根据是否在1.5s 值范围判断实验结果是否有效，每次测得值在平均值1.5S内方为有效。使用新批次的外部对照质控品时，必须重新绘制质控图。5.4.5 试剂盒质控品的使用每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的质控品，并满足质控品的要求。5.5 数据分析、结果报告5.5.1 在试剂盒及外部质控品结果满足要求的前提下，对样品进行分析。5.5.2 外部质控品不合格，样品需要重新检测。5.
26、5.3 结果超过检测上限的样品应稀释以后重新检测。5.5.4 复核人对检测结果进行仔细复核并对结果提出结论、签字。5.5.5 签发人对结果的结论进行审核、分析、总结、签字。5.5.6 按不同方法的要求，以拷贝/毫升或国际单位/毫升为单位报告样品的HIV-1病毒载量值。第六章 外部质量控制HIV-1病毒载量检测的外部质量控制可以通过参加外部质量评价，提高实验结果的可比性，发现系统误差，改进实验室工作，提高检测质量。艾滋病参比实验室自20XX年开始参加由美国国立卫生研究院（NIH）组织的HIV-1病毒载量检测考核工作，考核盘有5个样品组成，分别考核实验室检测的灵敏度、特异性、稳定性和准确性，通过将
27、结果与国际上参与考核的所有实验室结果进行比对评估，给出综合评估结果。通过参加考核，保证艾滋病参比实验室的不同HIV-1病毒载量检测系统的有效性。目前，艾滋病检测实验室通过参加艾滋病参比实验室组织的HIV-1病毒载量检测能力验证来实施外部质量控制。6.1 HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的组织艾滋病参比实验室为HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的组织者，负责制定国内HIV-1病毒载量检测能力验证的计划并组织实施。建议国内所有从事HIV-1病毒载量检测的实验室参加该PT项目，在规定时间内使用有效试剂与实验样品一起检测，填写HIV-1病毒载量实验结果报告单（附表4-6），上报艾滋病参比实验
28、室。鼓励有条件的实验室参加国际组织的PT活动。6.2 HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的实施6.2.1 PT样品组成：每次5份。包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。6.2.2 PT频率：一年2次，分别为3月和9月。6.2.3 PT样品的接收与保存：要求参加PT的实验室收到考核样品后，立即进行核对、检查，填写HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单（附表3），3天内将接收专用单传回艾滋病参比实验室。如发现考核样品缺失、量不足、空管等情况，及时书面回报，艾滋病参比实验室负责补寄或更换。收到样品后应及时检测或在-70度以下保存。6.2.4 PT样品的检测：要求将考核样品同实验室常规样品一起检测，由常规检测人员进行，不应作为特殊样品处理。
