1、结论NTFs及其受体在rhBMP2诱导成骨进程明显表达，提示NTFs可能通过直接和间接的方式协同BMP的诱导成骨进程。 关键词：骨形态发生蛋白； 骨诱导； 神经营养因子； 受体 Abstract：ObjectiveTo identify the expression of neurotrophic factors（NTFs）and their high affinity receptors（Trk）during the bone induction by recombined human bone morphogenetic protein2（rhBMP2）and discuss possib
2、le roles of NTFs on the osteoinductive activity of BMPMethodAfter a total of 36 ICR mice were divided into experimental group and control group at random,rhBMP2/collagen sponge and collagen sponge were implanted into the right thigh muscle pouches of two groups respectivelyTissues in the implanted s
3、ites of two groups were removed on the 7th,14th and 21st day after implantationHistological,immunohistochemical and RTPCR analyses were performed to detect osteoinductive effect of rhBMP2 and the expression of NTFs and TrkResultRhBMP2/collagen sponge displayed a potent ability inducing bone formatio
4、n,while the expression of NTFs and Trk was observed in the course of osteoinduction by rhBMP2Especially on the 7th day in the experimental group,NGF and TrkA positive immunostaining reached the peak in the stage of chondrogenesis,including chondroblasts,chondrocytes,hypertrophic chondrocytes and ost
5、eoblasts,then decreased in the number of positive cells and the intensity of immunostaining on the 14th and 21st dayBDNF was only observed in chondrocytes and cartilage matrix,and TrkB was expressed in chondroblasts and chondrocytes at the 7th day after implantationExpression of NT3 was similar to t
6、hat of NGF,while TrkC was expressed in chondroblasts and chondrocytes on day 7Expression level of the mRNA of NTFs peaked at 7 days after the implantation,then decreased,which was nearly coincident with immunohistochemical resultsConclusionMany different kinds of cells are induced by rhBMP2 express
7、NTFs and Trk,which suggests that NTFs may play an important role in the osteogenesis initiated by BMP through direct and indirect pathways Key words：Bone morphogenetic protein; Osteoinduction; Neurotrophic factors; Receptor 骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）能诱导未分化间充质细胞不可逆地分化形成骨和软骨，在骨折愈合和骨修复进程中发
8、挥着重要作用。研究表明，在骨折愈合中，除BMP的诱导成骨作用外，尚有其他众多因子的表达和参与，如TGF、VEGF、IGFI和bFGF等，以增进新骨的形成和成熟。神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）家族在中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活中起着重要的作用1。NTFs及其受体Trk在全身普遍散布，并在骨折愈合进程中有明显的表达2，外源性NGF具有增进骨折愈合的作用3。可是在外源性BMP诱导成骨进程中是不是也有NTFs及Trk的表达尚未见报导。本文对rhBMP2异位诱导成骨进程中NTFs、Trk的表达和NTFs mRNA的表达规律的研究进行报导。 1 材料
9、和方式 11 动物和材料 雄性ICR小鼠36只，体重2022 g。实验利用的rhBMP2胶原复合诱导材料（骨诱导，含rhBMP 2025mg片）和胶原海绵均由华东基因技术研究所提供。NTFs及TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，RTPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。 12 动物实验模型 将36只ICR小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只。氯胺酮腹腔注射麻醉，取rhBMP2复合材料12片（含0125 mg rhBMP2）植入实验组小鼠右边股后部肌间隙中，对照组小鼠植入相同大小胶原海绵。两组别离于术后第7、14和21 d遍地死6只小
10、鼠取材，别离进行组织学、免疫组织化学检测和NTFs mRNA的RTPCR检测。 13 检测项目 131 组织学观察 标本采用4多聚甲醛固定24 h，第14及21 d所诱导骨组织需采用10EDTA脱钙液脱钙，充分水洗，逐级脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，3m持续切片，行HE染色，光镜下观察。 132 免疫组化染色（SABC法） 石蜡切片经脱蜡入水后，3H2O2+甲醇灭活内源性过氧化氢酶，正常羊血清封锁，采用SABC法进行免疫组化染色。抗原经微波热修复后，别离滴加NGF、BDNF、NT3和TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体（工作液浓度为1200），室温下孵育2 h。生物素化山羊抗兔IgG及S
11、ABC复合物各孵育30 min，各步骤间均采用001 mol/L PBS洗涤。以二甲基联苯胺（DAB）显色，阳性显示为棕色，苏木素轻度复染。 133 RTPCR法检测NTFs mRNA的表达 采用Qiagen RNA试剂盒抽提实验组样本总RNA，采用Takara一步法RTPCR试剂盒扩增小鼠NGF、BDNF、NT3及内参照G3PDH的cDNA。经15琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶图像系统进行图像收集和分析。按照小鼠上述cDNA序列设计引物：NGF上游引物：5ATAAAGGTTTTGCCAAGGACG3，下游引物：5GGGGTCTACAGTGATGTTGCG3，扩增产物长度为281 bp。BDNF上
12、游引物：5GCCCAACGAAGAAAACCATAA3，下游引物:5TCGGCATTGCGAGTTCCAGT3，扩增产物长度为394 bp。NT3上游引物：5AGTGACAGCACCCCTTTGGAG3，下游引物：5CGGACATAGGTTTGCGAAGTT3，扩增产物长度为359 bp。以G3PDH作为内参照，其上游引物：5AAGGCTGTGGGCAAGG3，下游引物：5GGAGATTCAGTGTGGTGGG3，扩增产物长度为469 bp。将NGF、BDNF、NT3与内参照G3PDH的cDNA条带的吸光度对比，进行不同时间段的比较。 2 结 果 21 组织学观察 HE染色结果显示：实验组术后
13、第7 d，大量软骨前体细胞、软骨细胞和肥大软骨细胞周围形成，伴有毛细血管和间充质细胞侵入软骨组织中，并可见由此分化而来的成骨细胞。第14 d，大量的骨样组织和编织骨形成小梁状骨结构，可见原始骨髓腔、骨髓细胞，成骨细胞排列于骨组织表面，残留的软骨细胞转变成骨样细胞。第21 d，小梁骨进一步成熟，可见有编织骨塑形为板层骨，骨陷窝清楚可见，骨髓腔内有大量骨髓细胞和脂肪滴（图1）。对照组各时间段均未见有骨组织形成。 22 免疫组化染色 NGF和TrkA免疫组化结果显示：实验组术后第7 d，成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞、成骨细胞和周围的成纤维细胞中均有普遍的阳性染色，在部份软骨细胞外基质中也可见阳
14、性染色。第14 d，在新生骨组织表脸部份成骨细胞、成骨样细胞和幼稚骨样细胞中有阳性染色，同时破骨细胞和骨髓组织中的巨噬细胞和多核巨细胞亦呈现阳性染色。第21 d，阳性细胞进一步减少，仅在少数骨表面成骨样细胞和破骨细胞中有阳性染色，骨髓中巨噬细胞和多核巨细胞阳性表达亦减少。TrkA和NGF的表达大体相似（图2）。 BDNF和TrkB免疫组化结果显示：实验组术后第7 d，在软骨细胞和软骨基质中有明显的表达，尤其在软骨基质中表达最为显著；术后第14、21 d均未见明显阳性染色。TrkB仅于术后第7 d于软骨细胞和成软骨细胞中有阳性表达，而术后14、21 d未见表达（图3）。 NT3和TrkC免疫组化
15、结果显示：实验组术后第7 d，于成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中均见明显的阳性染色；术后14 d，于软骨细胞和成骨细胞中可见表达，术后21 d未见表达。TrkC仅于术后第7 d于成软骨细胞和软骨细胞中有表达，而术后14、21 d均未见表达（图4）。 23 NGF、BDNF、NT-3及G3PDH mRNA的检测结果 RTPCR结果显示：实验组于术后第7 d，NGF、BDNF及NT3 mRNA均有明显的表达。第14 d NGF及NT3 mRNA表达均有所减弱，而BDNF未见明显表达。第21 d NGF mRNA可见弱表达，而BDNF和NT3 mRNA无明显表达（图5）。 3 讨 论
16、BMP被发现以来，人们已熟悉到这种唯一具有异位诱导成骨能力的骨生长因子在骨折愈合进程中起着关键作用。大量实验和临床研究已证明天然和重组人BMP具有显著的诱导成骨、增进骨修复的作用。本研究组织学发现，rhBMP2胶原复合材料具有良好的异位诱导成骨能力，植入后第7 d即有大量软骨前体细胞、软骨细胞、成骨细胞和类骨组织的形成，周围有大量成纤维细胞增殖聚集，第14 d可见小梁状骨和骨髓腔、骨髓组织的出现，第21 d板层骨和成熟骨髓组织形成。而对照组未见任何成骨现象。 但骨折愈合、骨再生是一个十分复杂的进程，不仅有BMP的参与，其它因子在不同时期不同环节中也发挥着重要的作用，如TGF、VEGF、IGFI
17、和bFGF等。已有研究表明，神经纤维在骨组织中的支配对骨细胞代谢相当重要。在正常骨组织中存在普遍的交感神经和感觉神经支配4，尤其在生长板周围散布丰硕5。这些肽能神经可通过神经末梢释放相应的神经肽，作用于靶细胞来影响骨细胞的代谢6。在骨折愈合进程中，已有人证明新生骨痂中有大量新生神经纤维长入7，而且在失神经的情况下，骨折骨痂变大，而生物力学强度明显减弱8。说明神经因素在骨再生、骨组织修复进程中也起着重要的作用。 Barde以为神经元通过神经纤维支配其靶组织，而靶组织细胞分泌神经营养因子以营养其支配神经元。神经营养因子主要包括神经生长因子（nerve growth factor,NGF）、脑源性神
18、经营养因子（brainderived neurotrophic factor,BDNF）和神经营养素3（neurotrophin3，NT3）等，它们在中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活中起重要作用，而且在全身具有普遍的散布1。这些因子通过与其各自特异性的高亲和力受体（tyrosinekinase，Trk）TrkA、TrkB和TrkC结合，发挥其生理功能。1990年Frenkel第一次报导鸡胚软骨细胞和骨细胞中有NGF的表达，以为骨痂内和其它未成熟骨组织的细胞可产生NGF，以诱导神经纤维长入胚胎骨组织和骨痂中9。近来在正常骨组织中也发现有NGF、BDNF的表达，尤其在非负重骨中的含
19、量高于负重骨，可能与神经支配的丰硕程度有关10、11。 文献证明在骨折愈合的进程中，新生骨组织中有NGF、BDNF和NT3 3种神经营养因子及其受体TrkA和TrkC的表达二、3，而且于骨折部位应用外源性NGF具有增进骨折愈合的作用4。本研究第一次对rhBMP2诱导成骨进程中神经营养因子家族及其受体的表达进行免疫组织学观察。术后第7 d，可见普遍的NGF及TrkA阳性表达，第14、21 d表达减弱。BDNF及TrkB仅于第7 d有明显的表达。NT3于第7和14 d有较为普遍的阳性染色；TrkC仅于术后第7 d有表达。通过RTPCR检测，发现NTFs的mRNA表达与免疫组化观察结果相一致。由此可
20、以证明，外源性rhBMP2诱导成骨进程中有NTFs及其受体的表达，尤其以第7 d表达最为显著。按照NTFs在全身的作用，可以推断，在成骨进程中所表达的NTFs可能起着诱导神经纤维长入并支配新生骨组织的作用，从而通过一种间接途径神经系统来作用于再生骨组织；另一方面，其高亲和力受体在诱导成骨组织中的表达则表明NTFs可能通过自分泌或旁分泌的形式作用于局部细胞，从而直接影响骨再生进程。 总之，本研究证明了在rhBMP2骨诱导进程中NTFs及其受体的表达，提示NTFs可能在局部通过直接和（或）间接的方式影响BMP的诱导成骨进程，对其作用机理深切研究，将有助于增加对BMP骨诱导机理的熟悉，并为活性骨生物
21、材料的研究打下必然的基础。 参考文献： 1 Lewin GR,Barde of the neurotrophinsJ.Annu Rev Neurosci,1996,19:289317. 2 Grills BL,Schuijers localization of nerve growth factor in fractured and unfractured rat boneJ.Acta Orthop Stand,1998,69（4）:415419. 3 Asaumi K,Nakanishi T,Asahara H,et of neruotrophins and their receptors（
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23、nt in bone remodelingJ.Mic Res Tech,2002,58（2）:8590. 6 Imai S,Matsusue regulation of bone metabolism and anabolism:calcitonin generelated peptide,substance P,and tyrosine hydroxylasecontaining nerves and the boneJ.Mic Res Tech,2002,58（2）:6169. 7 Li J,Ahmad T,Spetea M,et reinnervation after fracture:
24、a study in the ratJ.J Bone Miner Res,2001,16（8）:. 8 Madsen JE,Hukkanen M,Aune AK,et healing and callus innervation after peripheral nerve resection in ratsJ.Clin Orthop,1998,351:230240. 9 Frenkel SR,Guerra LA,Mitchell OG,et growth factor in skeletal tissues of embryonic chickJ.Cell Tissue Res,1990,2
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