1、唐山师范学院综合性设计性实验项目申报表唐山师范学院综合性-设计性实验项目申报表 作者： 日期： 唐山师范学院综合性、设计性实验项目申报表申报单位名称： 生命科学系 2007 年 月 日实验项目名称唾液淀粉酶活性分析实验项目性质综合性 设计性所属课程生物化学实验开设学期第 3 学期综合/设计性实验学时数5实验室名称生物化学及植物生理学实验室地点5401每组人数4项目负责人李春香联系电话经费预算（元）500详细说明该实验涉及哪些知识点1、 唾液淀粉酶的制备2、 环境条件对唾液淀粉酶活性的影响3、 唾液淀粉酶的专一性4、 唾液淀粉酶活性的测定参加实验指导人员李春香、张淑红、高凤菊 实验项目建设进度安
2、排2007年6月：申报实验项目2007年6月2007年9月：准备试验材料及仪器，完善各项准备工作2007年10月：首次开设试验项目，进行效果分析主要仪器设备分光光度计 恒温水浴锅 电炉实验内容及拟达到的培养目标实验内容：学生自制唾液淀粉酶，分析影响唾液淀粉酶活性的环境条件，并在得出的最适条件下测定唾液淀粉酶的活性。培养目标：通过实验内容的学习，使学生从整体掌握酶学的基本知识以及测定酶活性的基本思路和方法；通过实验结果的分析，培养学生独立分析问题的能力。系论证意见系主任签名： （盖章）年 月 日主管部门意见（盖章）年 月 日综合性、设计性实验项目指导书生物化学实验实验项目：唾液淀粉酶活性分析张淑
3、红 编 写适用专业： 生物科学生物技术 唐山师范学院生命科学系2007年5月实验学时：5学时实验类型：综合性每组人数： 5 人组一、实验目的1、通过本实验的学习，使学生掌握酶学的基本知识，特别是唾液淀粉酶酶活性的测定方法。2、通过实验结果的分析，培养学生独立分析问题的能力，为今后的学习和科研工作奠定基础。 二、实验原理1、影响酶促反应的因素淀粉受唾液淀粉酶的作用水解成麦芽糖和少量葡萄糖。通常以测定淀粉水解的程度（底物减少）或麦芽糖生成的数量（产物增加）来衡量淀粉酶的活性。淀粉经淀粉酶水解后得到分子大小不相同的糊精，糊精遇碘生成不同的颜色。随着糊精分子量的降低依次为蓝色、紫色、暗褐色或红色、无色
4、。酶的活性受温度的双重影响。低温时酶活性表现较低，在一定范围内，酶活性随温度上升而增高。通常每升高10，反应速度增加一倍左右；另一方面，温度越高使酶蛋白变性越快，致使酶活性随温度上升而降低，以致完全丧失活性。当酶促反应速度达到最大值时的温度，称为酶作用的最适温度。本实验以唾液淀粉酶对淀粉的水解作用为例，观察0、37和100 三种温度对酶活性的影响。实验中各管除温度外，其它反应条件皆相同。唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精及麦芽糖。它们遇碘呈现不同的颜色反应，故可利用碘反应的颜色对比来判定不同温度下酶活性的大小。酶的活性受环境pH的影响极为显著。因pH影响酶蛋白和底物的解离状态，从
5、而明显改变酶与底物的结合和催化作用。每一种酶在一定的条件下都有它发挥作用的最适pH，此时酶的活性最大。当其它条件相同时，离最适pH越近，其活性越大，即所催化的反应速度越快。本实验利用唾液淀粉酶对淀粉的水解作用，在其它条件相同时，对比观察pH变化对酶活性的影响，用碘反应判断结果。另外激活剂和抑制剂对酶活也具有一定的影响，能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。2、酶作用的专一性麦芽糖和葡萄糖都具有还原性，能使班氏试剂中的二价铜离子（Cu2+）还原成一价铜离子（Cu+）生成砖红色的氧化亚铜沉淀。而蔗糖不能被水解也不具有还原性，故不能被班氏试剂还原。利用此性质
6、可以检测唾液淀粉酶的专一性。3、酶活性的测定酶活力也称酶活性，是以在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液在实验得出的最佳条件下，在一定的初始时间里将淀粉还原为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，在最佳实验条件下每分钟水解淀粉生成1mg还原糖作为一个淀粉酶活力单位，记为1U。在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量
7、与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。三、实验方案（一）唾液淀粉酶的制备1、每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。2、先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。3、口含约5mL蒸馏水，做咀嚼动作12min，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中。稀释至100mL，备用。（二）温度对酶活性的影响1、准备好37水浴、冰水浴及沸水浴，白瓷板中加碘液备用。2、取小试管4支，编号，各加1%淀粉溶液30滴，pH 6.8缓冲液10滴。1号管做对照，2号管放37水浴，3号管放冰水浴，4号管放沸水浴中，各预温10min。3、向1号管加蒸馏水10滴，向2、3和4号管各加稀释唾液
8、10滴，混匀，仍放原水浴中。4、5min后由2号管每隔一定时间（1或2min），取液一滴于白瓷凹板上做碘反应，观察并记录颜色变化情况，到碘反应接近浅红色时，取出各管，包括1号管，分别各取1滴做碘反应，观察对比结果。5、把4支试管均放入37水浴中，510min 后取出，向各管内加碘液2滴，混匀，观察结果。综合分析所测三种温度下的酶活性情况，并以1号管为对照说明冰水浴及沸水浴两温度对酶活性影响的异同，得出唾液淀粉酶的最适反应温度。（三）pH对酶活性的影响1、白瓷板中加碘液备用，准备好37水浴。2、取小试管4支，编号，按下表加入试剂，混匀。管号 1 2 3 4 1%淀粉（d） 30 30 30 30
9、 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（d） 10 10 10 10 (pH5.0) (pH6.8) (pH 8) (pH6.8)3、4号管加稀释唾液10滴, 放37水浴中，记时，每隔1由第4号试管中取出1滴溶液做碘反应，待碘反应呈浅红色或橙黄色时，取出试管，记录保温时间。4、13号试管放入37水浴中，以1min间隔，并记录时间，依次向1至3号管中加入稀释唾液10滴，摇匀，按照4号管的保温时间，以1min间隔，依次取出各管，并立即加碘液2滴，混匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH下淀粉被水解的程度，分析pH对淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH。（四）取4支试管，按下表编号后进行实验。管号12340.
10、1%淀粉溶液（d）30303030稀释的新鲜唾液（d）101010101% NaCl溶液（d）101% CuSO4溶液（d）101% Na2SO4溶液（d）10蒸馏水（d）1037恒温水浴中保温10minKII2溶液（d）23232323现 象（五）酶的专一性取试管3支，编号，按下表操作：管号 1231%淀粉 （d）10101% 蔗糖 （d）10pH6.8缓冲液 （d） 101010稀释唾液 （d） 5 5煮沸的唾液 （d）5各管混匀后，置37水浴中保温10min班氏试剂（d）202020将上述各管放沸水浴中煮沸35分钟, 观察结果。（六）唾液淀粉酶活性的测定1、标准曲线的制备取6支试管，按下
11、表加入1.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。项目空白12345葡萄糖溶液（mL）00.20.30.40.50.6蒸馏水（mL）32.82.72.62.52.4葡萄糖的浓度(mg/mL)01/151/102/151/63/15加热沸水浴加热5分钟冷却立即用冷水冷却光密度（OD540）取出后用流动水迅速冷却，在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2、唾液淀粉酶活性的测定1234最适pH值缓冲液（mL）11111淀粉溶液0.3%NaCl（mL）1111唾液淀粉酶（mL）1110蒸馏水（mL）0001酶促反应摇匀，最适温度下水浴5minDN
12、S试剂（mL）2222显色反应沸水浴5min取出后用流动水迅速冷却，稀释一定倍数，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量，计算酶的活性。四、主要仪器及试剂（一）试剂1、 1%淀粉2、 0.1mol/L pH5-8磷酸盐缓冲液：分别配制下列二液，再按下表混合后加水稀释一倍即可。（1）0.2mol/L NaH2PO4液：称取NaH2PO4 2H2O 31.2g ，加水准确定溶至1000mL。（2）0.2mol/L Na2HPO4 12H2O 71.64g ，加水准确定溶至1000mL。pH0.2mol/L NaH2PO4 (mL) 0.2mo
13、l/L Na2HPO4 (mL) 5 98.1 1.96.851.0 49.0 8 5.3 94.7 3、碘液：碘化钾1g加少许水溶解后，再加碘0.5g，溶后加水至100mL，混匀。用时加水稀释10倍。4、0.1% 淀粉溶液5、1% NaCl溶液6、1% CuSO4溶液7、1% Na2SO4溶液8、1% 蔗糖9、班氏试剂：柠檬酸钠173g和碳酸钠100g溶于约700mL水中，另将硫酸铜17.3g溶于100mL水中。可分别加热助溶。冷却后将两液混合，再加水至1000mL混匀。10、3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mo
14、l/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。11、葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为1.0mg/mL。12、1%淀粉0.3NaCl（二）仪器水浴锅；电炉；分光光度计五、实验要求要求学生预习生物化学教材中酶学一章的内容，特别是影响酶促反应因素一节。并且查阅资料了解DNS法测定还原糖的原理。 六、思考题1、比色时为什么要设计空白管？2、进行酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？七、实验报告实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对生物化学实验的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。实验报告的格式应为：1、实验目的；2、实验原理；3、仪器和试剂；4、实验步骤；5、实验结果；6、结果分析；7、思考题 实验报告必须独立完成，严禁抄袭。实验报告要用A4复印纸，并加封页，以便教师批阅，实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键，各种实验数据都要尽可能整理成表格并作图表示之，以便比较，一目了然。实验结果的分析要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用已学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
