1、外翻肠囊法研究葫芦素B胆盐磷脂混合胶束大鼠肠吸收动力学外翻肠囊法研究葫芦素B胆盐磷脂混合胶束大鼠肠吸收动力学 摘要研究葫芦素B胆盐磷脂混合胶束（Cu B-SDC/PLC-MMs） 在大鼠不同肠段的吸收动力学特征，并与葫芦素B混悬液进行对比。该研究采用外翻肠囊法制备离体肠吸收模型，高效液相色谱法测定葫芦素B的含量，研究Cu B-SDC/PLC-MMs在大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收状况，并考察不同质量浓度对肠吸收的影响。结果显示Cu B-SDC/PLC-MMs在不同肠段不同浓度下的吸收均为线性吸收（R2均大于0.9），符合零级吸收，且各肠段的吸收速率常数Ka随着药液中葫芦素B质量浓度的增加
2、而增加，提示其吸收机制可能为被动吸收。Cu B-SDC/PLC-MMs在回肠段吸收最好，且各肠段的吸收均高于葫芦素B混悬液。磷脂胆盐混合胶束能显著增强葫芦素B的肠吸收，该肠吸收的研究为其进一步合理固化提供依据。 关键词葫芦素B;磷脂胆盐混合胶束;外翻肠囊法;吸收动力学 Rat intestine absorption kinetics study on cucurbitacin B-sodium deoxycholate/ phospholipid mixed nanomicelles with in vitro everted gut sacs model CHENG Ling1， 2， S
3、HEN Bao-de2， LI Juan-juan1，2， QIU Ling1，2， SHEN Gang1，2， ZHANG Li-hong2， HAN Jin2*， YUAN Hai-long2* （1. College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China; 2. 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China） AbstractTo investigate the absorption kine
4、tics of Cu B-SDC/PLC-MMs in rat different intestinal segments and compared with the absorption of Cu B suspension. The in vitro everted gut sacs model was established to study the absorption characteristics of Cu B-SDC/PLC-MMs in rat duodenum， jejunum， ileum and colon， and the content of cucurbitaci
5、n B was detected by HPLC method， and the effects of concentrations on intestinal absorption were evaluated as well. The results showed that the absorption of Cu B-SDC/PLC-MMs was linearity at different intestine segment and different concentrations（R20.9）， which was consistent with zero order rate p
6、rocess. The Ka of different intestine segments showed a concentration-dependent increasing along with the raised concentration of Cu B-SDC/PLC-MMs， indicating that it was likely to be a mechanism of passive absorption. The best absorption site of Cu B-SDC/PLC-MMs was ileum， and its absorptions in di
7、fferent intestinal segments were superior to cucurbitacin B suspension. SDC/PLC-MMs could significantly enhance the intestinal absorption of cucurbitacin B， and the study of intestinal absorption kinetics of Cu B-SDC/PLC-MMs had gave a support to its further reasonable solidfication. Key wordscucurb
8、itacin B; sodium deoxycholate/phospholipid mixed nanomicelles; in vitro everted gut sac; absorption kinetics doi：10.4268/cjcmm20151435 葫芦素（cucurbitacin）是从葫芦科植物中提取的一类高度氧化的四环三萜类化合物，其种类至今已达40余种，其中葫芦素B（cucurbitacin B，Cu B）是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有广泛的生物活性<sup>1</sup>。现代药理研究表明，葫芦素B具有保肝、抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力
9、等作用，临床上主要用于治疗肝炎和原发性肝癌<sup>2</sup>。目前市售的葫芦素片主要含Cu B活性成分，其含量高达60%，但Cu B属于难溶性药物，口服生物利用度低，且具有剂量依赖性的胃肠道不良反应，极大地限制了其临床应用。 目前，为克服Cu B临床应用的不便，国内外开展了系列的制剂学研究，如Cu B水醇凝胶、Cu B固体脂质纳米粒、Cu B自微乳、Cu B毫微球、Cu B聚合物胶束等<sup>2-6</sup>的制备，但口服制剂的研究甚少。胆盐/磷脂混合胶束（sodium deoxycholate/phospholipid mixed n
10、anomicelles， SDC/PLC-MMs）是常用的口服制剂，其具有“混合型圆盘结构”，其中卵磷脂的碳氢链形成疏水性核心，胆盐的疏水基团嵌入磷脂的双分子层中，对药物起增溶、保护、减少消化道刺激等作用，能显著提高难溶性药物的溶解度，增强药物的稳定性，提高药物的口服生物利用度<sup>7</sup>。药物的肠吸收研究是表征口服制剂体内吸收程度和吸收速率最常用的评价手段，对于合理选择制剂，安全用药，提高口服生物利用度具有指导意义<sup>8</sup>。本试验拟采用肠外翻生物模型研究葫芦素B胆盐磷脂混合胶束（Cu B-SDC/PLC-MMs）的肠
11、吸收动力学特征，探讨Cu B-SDC/PLC-MMs的最佳吸收部位和吸收机制，为其进一步合理固化提供依据。 1材料 LC-20A岛津液相色谱仪（日本岛津公司）;Winner801纳米激光粒度仪（济南微纳颗粒仪器股份有限公司）;JS94J2 Zeta电位测量仪（北京中仪远大自动化技术有限公司）;WH861涡旋混合器（北京科尔德科贸有限公司）;85-2恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）。葫芦素B原料药（Cu B，批号130301，南通飞宇生物科技有限公司）;葫芦素B对照品（批号130111，上海源叶生物科技有限公司）;脱氧胆酸钠（批号K0250，北京恒泰拓达有限公司）;卵磷脂（PC95%，批号
12、130914，上海太伟药业有限公司）;水合氯醛（北京东方龙顺化学合成技术开发中心）;羧甲基纤维素钠（CMC-Na，北京凤礼精求商贸有限责任公司）;Krebs-Ringers营养液（简称K-R缓冲液，自配，每1 L含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g， CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖 1.4 g）;甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 清洁级Wistar大鼠，体重200220 g，雌雄各半，军事医学科学院动物中心提供，动物合格证号SCXK-（军）2012-004。 2方法与结果 2.1Cu B-SDC/P
13、LC-MMs的制备<sup>9</sup> 采用薄膜分散法制备Cu B-SDC/PLC-MMs溶液，根据实验室前期优化的处方，精密称取卵磷脂3 g于适量无水乙醇中，完全溶解后于氮气下吹干大部分有机溶剂，再在真空干燥箱中挥去微量的有机溶剂，即得脂膜。将脱氧胆酸钠2.4 g溶解于PBS（pH 7.4）100 mL中制成胆盐溶液，将上述脂膜与胆盐溶液在45 水浴中超声混合45 min，即得澄清透明的空白SDC/PLC-MMs溶液。然后将葫芦素B粉末0.5 g加入到上述空白胶束溶液中，氮气密封，于磁力搅拌器上恒温搅拌24 h。用0.45 m微孔滤膜过滤，即得包封率为95.73%
14、的Cu B-SDC/PLC-MMs。 2.2Cu B-SDC/PLC-MMs粒径、Zeta电位的测定 取Cu B-SDC/PLC-MMs适量，加蒸馏水稀释至合适浓度，分别采用激光粒度仪和Zeta电位测量仪测定其粒径、多分散指数（PI）及Zeta电位，重复测定3次，取平均值。Cu B-SDC/PLC-MMs平均粒径为（89.575.53） nm，PI为0.183 10.008 3，Zeta电位为（-33.511.17） mV。 2.3Cu B-SDC/PLC-MMs的稳定性测定 将按一定比例稀释后的Cu B-SDC/PLC-MMs置于室温下保存7，14，20，30，60，90 d，以2.2项下方
15、法测定粒径、PI及Zeta电位。结果见图1，2，上述稀释后的Cu B-SDC/PLC-MMs外观仍澄清透明，粒径、PI及Zeta电位均无显著性变化。 2.4方法学考察 2.4.1色谱条件Arcus EP-C18色谱柱（4.6 mm250 mm， 5 m）;流动相为甲醇-水（6040）;检测波长为228 nm;柱温为室温;体积流量1.0 min?mL-1;进样量20 L。 2.4.2对照品溶液的制备精密称取葫芦素B对照品15.84 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，精密吸取1 mL，加甲醇定容至50 mL，得31.68 mg?L-1的葫芦素B对照品储备液。 2.4.3供试品溶
16、液的制备精密吸取各时间点样品200 L于EP管中，加入甲醇400 L涡旋振摇1 min，于8 000 r?min-1离心10 min，吸取上清液于室温下氮气吹干，残渣加甲醇200 L溶解，充分涡旋振荡，8 000 r?min-1离心10 min，取上清液即得。 2.4.4专属性考察取Cu B对照品溶液、空白肠营养液（K-R液）及2.4.3项下供试品溶液，依照2.4.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图3。空白肠营养液与Cu B对照品在相同保留时间处未出现色谱峰，故认为空白肠营养液对测定无干扰。 2.4.5线性关系考察精密吸取质量浓度为31.68 mg?L-1的Cu B对照品储备液适量，用空
17、白肠营养液按不同比例稀释成质量浓度为0.528 0，1.056，2.112，2.640，5.280，10.56，21.12 mg?L-1的系列溶液，混匀离心后取上清液按2.4.1色谱条件进样分析，以峰面积（Y） 对Cu B质量浓度（X）进行线性回归，得标准曲线方程Y=54 282X-13 900，R2=0.999 6，表明Cu B在0.52821.12 mg?L-1呈良好线性关系。 2.4.6精密度试验精密吸取2.4.5项下质量浓度为5.280，10.56，21.12 mg?L-1的Cu B对照品溶液，按2.4.1色谱条件进样20 L，每日测定3次，计算日内精密度。每浓度连续测定3 d，计算日
18、间精密度。结果显示，高、中、低浓度的Cu B对照品的日内精密度RSD 1.1%1.8%，日间精密度RSD 1.4%2.1%，符合生物样品分析要求。 2.4.7稳定性试验分别取同一取样点同一肠段高、中、低剂量的Cu B混悬液组和Cu B-SDC/PLC-MMs组的肠外翻样品，于0，1，2，6，12，24，72 h分别进样，测定Cu B的含量。结果表明，高中低不同剂量的Cu B混悬液组和Cu B-SDC/PLC-MMs组的肠外翻样品，在72 h内Cu B的含量没有显著性变化，其RSD为1.3%2.3%，0.93%2.2%，表明样品稳定性良好。 2.4.8回收率试验精密量取已知质量分数的肠外翻样品6
19、份，分别加入精密量取的Cu B对照品，按2.4.3项下方法处理，并于上述色谱条件下进样分析，结果回收率均在95.89%103.7%，说明本方法准确度良好。 2.5大鼠外翻肠囊法实验 2.5.1肠囊供试液的制备分别取一定量的Cu B原料药与Cu B-SDC/PLC-MMs溶液，用K-R空白缓冲液定容，配制成 50，25，12.5 mg?L-1（以Cu B计）的高、中、低剂量的肠囊供试液，其中Cu B原料药组分别加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），磁力搅拌30 min，临用前配制，得混悬均匀的Cu B肠囊供试液。 2.5.2外翻肠囊实验参照文献方法<sup>10-11</
20、sup>，选取30只健康大鼠，随机分成6组，分别为Cu B-SDC/PLC-MMs高、中、低剂量组，Cu B混悬液高、中、低剂量组。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL?kg-1），于剑突下2 cm处开腹腔，小心剥离肠管周围的肠系膜，至幽门1 cm处取10 cm为十二指肠段，至幽门15 cm处取10 cm为空肠段，距盲肠上20 cm处取10 cm为回肠段，结肠段紧邻回肠与盲肠段，长10 cm。将各肠段小心取出，分别置于37 的K-R空白缓冲液中，反复清洗，至无内容物流出，小心剥离肠段表面的肠系膜、血管和脂肪。接着将肠管一端结扎，用大鼠灌胃针头小心将肠段翻转使
21、浆膜层在内，黏膜层在外，用K-R空白缓冲液冲洗后，将另一端结扎于蝴蝶针塑料套管上，便于取样。向肠囊内注满空白K-R缓冲液，记录体积（V），并测量其长度（L）及底面直径（D）。平衡5 min后，将其分别放入37 含有不同浓度肠囊供试液的15 mL浴管里，并通入95% O2/5% CO2的混合气体，实验过程中维持水浴温度37 。分别于15，30，45，60，90，120 min时从肠囊内取样250 L，同时补加同温同体积的空白K-R缓冲液。将各时间点样品，按2.4项下进样测定，计算吸收动力学参数。 2.5.3统计方法药物各时间点单位肠管面积累积吸收量（Q，g?cm-2），药物吸收速率常数（Ka，g
22、?min-1?cm-2），表观渗透系数（Papp，cm?min-1）的计算公式见下<sup>11</sup>。 Q=（CnV+n-1i=1Ci0.25）/A（1） Ka=dQ/dt（2） Papp=dQ/dt/Co（3） 其中，Co表示肠囊供试液的初始浓度（mg?L-1），Cn表示n时间点的实际检测质量浓度（mg?L-1），Ci为样品质量浓度（mg?L-1），V指各肠段灌满K-R缓冲液时的体积（mL），A指药物透过的表面积（即本模型中肠腔膜面积，cm2）。数据以s表示，用SPSS 17.0进行分析，各组间（如肠段、剂量组）Ka的比较采用单因素方差分析（One-way a
23、nalysis of vatiance， ANOVA），2组间Ka的比较采用独立样本t检验，P<0.05认为具有统计学差异。 2.6外翻肠囊法实验结果 2.6.1Cu B-SDC/PLC-MMs在不同肠段、不同药物浓度下的肠吸收情况按2.4项下色谱条件进样分析，分别测定Cu B-SDC/PLC-MMs各剂量组肠外翻样品中Cu B的含量，以各时间点单位肠管面积累积吸收量（Q）对时间（t）作图，求得吸收速率常数Ka，结果见表1。Cu B-SDC/PLC-MMs在不同肠段均有吸收，且各肠段的吸收均为线性吸收，其回归相关系数（R2）均大于0.9，符合零级吸收速率<sup>11<
24、/sup>。 分别对相同浓度下不同肠段的吸收速率常数Ka与表观渗透系数Papp进行单因素方差分析比较，结果显示，相同浓度下回肠的Ka与Papp均最大，并与十二指肠、空肠存在显著性差异（P<0.01），可知肠囊对Cu B-SDC/PLC-MMs的吸收具有肠段依赖性。 分别对不同浓度下同一肠段的吸收情况进行比较，结果4个肠段的吸收变化趋势一致，随着肠囊供试液中Cu B-SDC/PLC-MMs质量浓度的增加，同一肠段的吸收速率常数Ka也增加，且肠段的吸收均为零级吸收，表明Cu B-SDC/PLC-MMs的吸收机制可能为被动吸收，肠囊对Cu B-SDC/PLC-MMs的吸收具有浓度依赖性。
25、 2.6.2Cu B-SDC/PLC-MMs组与Cu B混悬液组肠吸收动力学参数的比较分别对相同浓度同一肠段Cu B-SDC/PLC-MMs与Cu B混悬液组的Ka与Papp进行两两比较，结果Cu B-SDC/PLC-MMs组在高、中、低3种浓度下，4个肠段的Ka与Papp均大于Cu B混悬液组，其中回肠、结肠段具有显著性差异，见图4，5。 3讨论 常用的药物肠吸收研究方法有离体外翻肠囊法<sup>10-11</sup>、在体单向肠灌流法<sup>12</sup>、在体肠循环法<sup>13</sup>和Caco-2细胞模
26、型<sup>14</sup>等。其中，离体外翻肠囊法操作简单、快捷、重复性好，既保持了组织和黏膜的完整特性，又能避免循环系统、消化系统及各种内容物的干扰与影响。虽与药物的实际吸收存在一定差异，但目前仍广泛应用于药物肠道最佳吸收部位的探寻及肠壁转运机制的研究<sup>10-11</sup>。 课题组沿用前期实验大鼠的有效给药剂量2 mg?kg-19，将本研究的肠囊供试液浓度折算为12.550 mg?L-115，即各离体肠段置于15 mL含药量为0.187 50.75 mg的肠囊供试液中，该浓度范围基本能代表Cu B-SDC/PLC-MMs在安全有效
27、剂量下的肠吸收情况。实验中为保证离体组织的生理活性，减少肠囊的通透性变化，将外翻肠囊实验的取样时间定为120 min<sup>15</sup>，基本能满足肠细胞的正常活性。 药物的分散状态直接影响药物的吸收，Cu B为难溶性药物，其吸收需经历溶出、分散和吸收过程，其中溶出速率是影响肠壁吸收的关键因素。实验中Cu B混悬液组均加入了CMC-Na助悬剂<sup>11</sup>，以保证Cu B组与Cu B-SDC/PLC-MMs组的混悬一致性状态，减少实验组之间的客观影响因素。外翻肠囊实验结果显示，Cu B-SDC/PLC-MMs组在相同浓度下的吸收
28、速率常数与表观渗透系数均高于Cu B混悬液组，且各肠段的变化趋势一致，分析可能的原因：Cu B-SDC/PLC-MMs的粒径小于100 nm，比表面积大，使药物能较长时间与肠黏膜上皮细胞接触，以促进药物的吸收;磷脂是细胞膜的重要组成成分，其与胆酸盐形成的混合胶束与肠细胞膜具有良好的亲和力，促进药物的吸收;胆酸盐是常用的渗透促进剂，可增强肠壁的通透性，提高药物的跨膜特性，从而促进药物的吸收。因此， Cu B-SDC/PLC-MMs肠吸收行为的研究为其进一步合理固化（如肠溶微丸）提供了重要的指导意义。 参考文献 1张延亭， 欧阳东云， 何贤辉， 等. 葫芦素B抗肿瘤作用及其机制研究进展J. 中国药
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