1、届一轮复习浙科版微生物的利用教案浙江专用选考加试部分第十二章生物技术实践第30讲微生物的利用浙江学考选考考纲确认考点知识内容加试一、微生物的利用1.大肠杆菌的培养和分离2.分离以尿素为氮源的微生物掌握程度参考考试标准的：二、(二)3.实验与探究能力考点一| 大肠杆菌的培养和分离1微生物的实验室培养(1)培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。(2)无菌技术(3)实验操作牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备：计算称量溶化灭菌倒平板。2细菌的分离方法：划线分离法和涂布分
2、离法(1)划线分离法方法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，使聚集的菌种分散到培养基的表面。每个菌落就是一个细菌产生的后代。应用：用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因)，如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到107105倍，然后取0.1 mL稀释度不同的菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落
3、。3大肠杆菌的培养和分离(1)大肠杆菌特点：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。(2)细菌的繁殖：以二分裂的方式繁殖，分裂速度很快。(3)细菌的扩大培养：用LB液体培养基，划线分离用LB固体平面培养基。(4)大肠杆菌的分离操作技术最常用方法是划线分离法，其操作步骤是：培养基灭菌：将刚配制好的50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基分别装入两个250 mL的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。倒平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中，三角瓶在37 ，每分钟200
4、转的摇床中振荡培养12 h。划线分离：将摇床上培养12 h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37 恒温培养箱中进行培养，1224 h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已经分离。菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37 下培养24 h后，置于4 冰箱中保存。1消毒和灭菌的区别项目条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压
5、蒸汽灭菌2几种消毒和灭菌方法及其适用范围类型适用范围操作方法消毒方法煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体7075 煮30 min或80 煮15 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30 min灭菌方法灼烧接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160170 加热12 h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，121 ，1530 min3.细菌的两种分离方法的比
6、较项目划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，但操作复杂目的使培养基上形成单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落1检验饮用水的细菌含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：(1)要
7、测定饮用水中大肠杆菌的数量，常采用_法，通常将水样进行一系列的梯度_，然后将上述的水样用涂布器分别涂布到_的表面进行培养，记录菌落数量。用该方法统计样本菌落数时_(填“是”或“否”)需要对照组。原因：_。(2)下面所示的四种菌落分布图中，不可能由上述方法得到的是_。(3)大肠杆菌的培养条件是无菌，配制培养基时需加入氯化钠，以维持_。配制培养基时先_(填“调节pH”或“灭菌”)后_(填“调节pH”或“灭菌”)。【答案】(1)涂布分离稀释LB固体培养基是因为需要判断培养基使用之前是否被杂菌污染(培养基灭菌是否合格)(2)D(3)渗透压调节pH灭菌2(20161月宁波期末测试)石油烃是环境的重要污染
8、源。为了筛选出具有强分解石油烃能力的微生物，进行了一系列操作，请回答下列问题：(1)分解石油烃的微生物一般要从土壤中分离，获取土壤样品的取样地点最好选在_。(2)微生物实验室常采用_法对培养基进行灭菌处理。A干热灭菌 B过滤灭菌C灼烧灭菌 D高压蒸汽灭菌(3)下图为获取土壤样品后的培养研究过程：为了能有效地分离出分解石油烃的微生物，过程所用培养基的成分的特点是_，从而有利于分解石油烃的微生物的生长。(4)对进行接种时常采用的两种方法分别是_和_。(5)若发现在中无法区分菌落，可以将图中取出的菌液_。(6)若实验室为分离纯化优良菌种进行了如下操作，排序最合理的是_。A BC D(7)整个微生物的
9、分离和培养的操作，一定要注意在_条件下进行。【解析】(1)分解石油烃的微生物在石油污染明显处分布较多。(2)微生物实验室对培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌法。(3)实验过程中，过程所用培养基应以石油烃作唯一碳源，以抑制其他种类微生物的生长，从而分离出分解石油烃的微生物。(4)在微生物的分离实验中，常用划线分离法或涂布分离法进行接种。(5)若发现在中无法区分菌落，可能是菌液中细菌浓度太高，可进行梯度稀释处理后再接种。(6)图示为用划线法进行接种分离。接种过程中应先在酒精灯火焰上灼烧接种环，然后蘸取菌液进行接种，整个操作在酒精灯火焰旁进行，接种结束后还须在酒精灯上灼烧接种环。(7)为避免污染，整个微生物
10、的分离和培养的操作，一定要注意在无菌条件下进行。【答案】(1)石油污染明显处(2)D(3)以石油烃为唯一碳源(4)划线分离法涂布分离法(5)进行(梯度)稀释(6)B(7)无菌考点二| 分离以尿素为氮源的微生物1菌种特点含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源，其反应式为：CO(NH2)2H2O2NH3CO2。2培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，用LB全营养培养基作为对照。3实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使培养基pH升高，使酚红指示剂变红。4实验步骤(1)制备培养基：将已灭菌的LB固体培养
11、基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，平放至凝固。(2)制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液。(3)用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上。(4)培养：将培养皿倒置，在37 恒温箱中培养2448 h。(5)观察：观察培养基中菌落的数量。5反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解，产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色的环带。1分离以尿素为氮源的微生物的注意事项：(1)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶分解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色
12、环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(2)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。(3)本实验中配制固体培养基时应选用琼脂糖而不能选用琼脂作凝固剂。这是由于琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(4)由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用G6玻璃漏斗过滤的方法。并且应在基本培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至60 时再
13、加入。(5)土样应从有哺乳动物排泄物的地方取得，这是由于动物排泄物中有一定量的尿素，在这些土壤中一般含有较多的分解尿素的细菌。2微生物数量的统计方法常规的计数方法是涂布分离法和显微镜直接计数法。(1)涂布分离法 该法的基本原理是：将待测含菌样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，然后取一定量的稀释样品液，接种到平板上。经过一定时间培养后，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。最后统计菌落数，根据其稀释倍数和取样量，换算出单位样品中所含的活菌数。实际上，由于待测样品不易完全分散成单个细胞，故所形成的菌落并非都是单菌落，有一部分是由两个或两个以
14、上的细胞长成的，因此平板菌落计数的结果会比实际偏低。现在已采用菌落形成单位(cfu)来表示样品的活菌含量。用涂布分离法计数时，一般选择菌落数在30300的平板计数，同时做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度。对分解尿素的微生物计数时，一般制备成102、103、104、105土壤稀释液。(2)显微镜直接计数法测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法，该法操作方法是取酵母菌或霉菌孢子悬液，滴加在血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。1(2017温州中学检测)尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某
15、些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：K2HPO4NaClH2O葡萄糖尿素酚红琼脂0.12 g0.12 g15 mL0.025 g2.0 g0.25 mg0.5 g(1)分解尿素的细菌都能合成_，该种细菌在生态平衡中起到什么作用？_。写出细菌分解尿素的方程式：_。(2)根据培养基的成分，判断该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌。_(填“能”或“不能”)，原因是_。(3)分离得到分解尿素的细菌后，如果要扩大培养，则应选择_培养基进行培养。培养一段时间后，使用_对微生物细胞进行计数。计数过程中，下列行为会影响计数的准确性的是_。
16、A计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数B如果方格内微生物细胞数量多于300个，需将培养液先稀释后再计数C如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞D压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数(4)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用_技术。【解析】(1)含有脲酶的细菌通过降解尿素为氨获得生长的氮源，从而也起到维持生物圈中氮元素平衡的作用。(2)从培养基的成分看，配方中含有琼脂，不能分离出分解尿素的细菌。原因为琼脂是一种未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(3)扩大培养需要使
17、用液体培养基，对微生物或者酵母菌等进行计数时常用血细胞计数板。计数过程需要注意操作规范，如A选项所述的操作会影响计数的准确性，应该使细菌分布均匀后取样。(4)固定化酶技术可以提高酶的利用率。【答案】(1)脲酶参与氮循环(或维持氮平衡)CO(NH2)2H2O2NH3CO2(分子式、符号、条件缺一不可)(2)不能琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，以致尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物(3)液体血细胞计数板A(4)固定化酶2(2017嘉兴模拟卷)为了从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物，某小组做了相关实验，其基本流程如下。请回答下列问题： (1)实验流程中，物质甲是_。为
18、了体现尿素培养基的分离效果，需设置对照组，对照组的培养基是_培养基，该培养基常用的灭菌方法是_。(2)下表中有四种培养基，为了分离出以尿素为氮源的微生物，应采用的培养基是_。培养基蛋白胨葡萄糖NaClK2HPO4酚红琼脂糖琼脂水尿素ABCD(3)制备菌液时，步骤乙的操作是_。A灭菌 B稀释C过滤 D扩大培养(4)为了统计每克土壤样品中以尿素为氮源的微生物的数目，接种时宜采用_法。将相同浓度的土壤稀释液分别接种在实验组和对照组培养基上，在温度为_的恒温培养箱中培养2448 h，观察比较菌落数，发现对照组培养基中菌落的数目比实验组_。【解析】(1)为了从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物，需要用无菌
19、水制备土壤浸出液，为了体现尿素培养基的分离效果，需设置对照组，对照组的培养基为LB全营养固体培养基，以观察全营养生长细菌的菌落数。LB全营养培养基可用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)为了分离出以尿素为氮源的微生物，应采用以尿素为唯一氮源并添加酚红指示剂的培养基，同时培养基中应加入葡萄糖提供碳源，用琼脂糖作凝固剂。(3)为获得单菌落，需要对土壤浸出液进行梯度稀释。(4)用于微生物计数时，接种可采用涂布法，大多数细菌生长的适宜温度为37 左右。将相同浓度的土壤稀释液分别接种在实验组和对照组培养基上，在37 的恒温培养箱中培养2448 h，发现对照组培养基中菌落的数目比实验组多。【答案】(1)无菌水LB全营养固体高压蒸汽灭菌法(2)A(3)B(4)涂布37多
