1、3、了解灭菌的常用方法及应用对象。4、学习高压蒸汽灭菌锅的操作方法及注意事项。5、学习干热灭菌的操作技术。6、了解分离培养微生物前的有关准备工作。二、基本原理培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，它是进行科学研究，生产微生物制品及应用等方面的基础。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需要不同，选择配制不同的培养基。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，
2、而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在1213灭菌20分钟即可。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170），时间长（12小时）。但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。三、实验器材1、试剂牛肉膏、蛋白胨
3、，氯化钠，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl等。2、仪器和其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，培养基分装器，天平，药勺，高压蒸汽灭菌锅，pH计，pH试纸等。四、实验操作步骤（一）、培养基的配制称量 -熔化- 调pH -过滤-分装 - 加塞 - 包扎标记 - 灭菌 - 搁置斜面或倒平板 - 无菌检查配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH7.4-7.6。固体培养基一般加琼脂15-20g。1、牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备（以每组300ml计）（1）称量：除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。蛋白胨极易
4、吸水，称量时动作要快。（2）熔化：量取蒸馏水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。（3）调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH7.4-7.6。若偏碱，则用1mol/L HCl调节。（4）过滤：趁热过滤。如无特殊要求，可省略。（5）分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，每组分装6支试管。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。在漏斗下口处套有一段透明胶
5、管，胶管下部用弹簧夹夹紧。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。（6）加塞：试管加棉花塞（或泡沫塑料塞、试管帽），三角瓶加棉塞或泡沫塑料塞。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞做成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。
6、棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。（7）包扎标记：6支试管扎成一捆，棉塞外加一层牛皮纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用绳扎成活结。三角瓶棉塞外加盖牛皮纸，用绳扎成活结。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。（8）灭菌：0.1MPa，121，20min高压蒸汽灭菌。见实验流程（三）。（9）搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。（10）倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50左右，倒平板。备用。（11）无
7、菌检查：灭菌培养基放入37培养箱中24-48小时，若无细菌污染则说明灭菌彻底。2、牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备（600-800ml/班，由2组同学或教师完成）老师代按培养基配方比例依次准确地称取药品，除琼脂外，方法同固体培养基的制备过程。各组需完成：用分装装置将培养液分装到试管中，高度为试管长度的1/4。每组6支试管，自行分装、包扎、灭菌。（二）、准备无菌器材1、培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将10-12套培养皿叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，然后进行灭菌。2、移液管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支
8、吸管用一条宽约45cm的纸条，以3050的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。每组1ml移液管5-6支、10ml移液管1支3、试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞。每组捆扎加塞试管4-5支，每组用三角烧瓶装入不超过三角瓶容积1/2的去离子水。4、玻璃涂布棒：1支用报纸包好。上述物品用记号笔注明班级、组别、日期。（三）、灭菌操作步骤1、高压蒸汽灭菌（1）关好排水阀门，放入蒸馏水至标度。注意水量一定要加足，否则容易造成事故。（2）将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定
9、程度（不要太紧），然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。（3）通电加温，打开排气阀门，排尽锅内的空气。全自动高压锅应关闭排气阀，（4）恒温灭菌: 0.1MPa 或15磅压力（锅内温度相当于120121）保持2030分钟。（5）降温：自然降温，当锅内蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，才能打开排气阀。（6）取出灭菌物品：如培养基需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上。培养基、无菌水等：湿热灭菌。2、干热灭菌（1）将包扎好的玻璃器皿摆入电热烘箱中，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。（2）关紧箱门，打开排气孔，接上电源。（3）待箱内空气排出到一
10、定程度时，关闭上排气孔，加热至灭菌温度后，固定温度进行灭菌：150170灭菌1.52h。2小时后切断电源。（4）待烘箱内温度自然降温冷却到60以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 放入烘箱加热灭菌：玻璃器皿：可选择干热灭菌或湿热灭菌五、注意事项1、培养基的配制加热熔化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其它固体物质粘在烧杯底上烧焦。加热过程中所蒸发的水分应补足； pH值必须按不同培养基要求准确测定；所有器皿要清洁，忌用钢质、铁质器皿；分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端以免浸湿棉塞，引起杂菌污染；培养基灭菌的时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以达到灭菌
11、效果且不损害必要营养成分；灭菌后的培养基须放37温箱内培养24h，无菌生长时方可使用。2、灭菌使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故，如锅内应加足水份，以防干烧；灭菌时，操作者切勿擅自离开；务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。待烘箱内温度自然降温冷却到60以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。六、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查培养基灭菌是否彻底？2、高压蒸汽灭菌开始前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什
12、么待压力降至0时才能打开排气阀，开盖取物？七、讲授重点1、培养基种类、配制培养基的基本原理与方法。2、高压蒸汽灭菌和干热灭菌的原理和规范操作流程。八、实验要求每组需完成制作棉塞、配制培养基、准备无菌器材九、考核点操作是否规范、迅速第二次实验（4学时，1人/组）实验二 微生物的分离、接种及环境微生物的检测（9月28日）1、体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。2、证实环境中存在微生物。3、掌握倒平板的方法。4、学习微生物接种的基本技术。5、学习分离微生物的常用方法。高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌的目的。自然界中各种微生物混杂生活在
13、一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法常用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。2、培养基牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基。3、仪器和其他用具
14、接种环、酒精灯、试管架、记号笔、培养皿、恒温培养箱等。四、实验步骤1、微生物接种技术（1）试管斜面接种法（用接种环转接菌种）：标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。取菌：左手拿大肠杆菌试管斜面培养物，右手持接种环，将接种环在火焰上进行灼烧灭菌，然后在火焰旁用右手小指指和无名指或右手掌缘拔出并夹住试管棉塞，试管口在火焰上烧一下。接种环轻轻插入斜面上半部，在管壁冷却水上或管壁上使接种环冷后，挑起少许菌苔，再烧一下试管口，塞上棉塞，左手把斜面试管放回试管架。右手持有菌接种环在酒精灯旁无菌区。接种：左手从试管架上取出标记好的斜面试管一支，右手掌缘拔出棉塞，试管口
15、在酒精灯上灼烧一下，沾有菌苔的接种环迅速放进斜面底部，从下到上划一直线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，烧一下试管口，塞上棉塞，接种环在火焰上灼烧后放回原处。培养：试管放37培养箱中培养24-36小时。（2）液体培养基接种法：接种流程同（1）。接种时略有不同，即将挑有菌苔的接种环在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。轻轻摇匀培养液。2、平板分离技术（1）稀释涂布平板法：倒平板：灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基冷却到55左右，摇匀。解开麻绳，去掉三角瓶口上的牛皮纸和纱布，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。左手持9cm无菌培养皿并将皿盖在火焰旁打开一
16、条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，平置于桌面上，使培养基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。菌液稀释：取4支无菌试管，每管加9 ml无菌水，无菌操作取1ml大肠杆菌菌液至9ml无菌水中混匀，依次进行10倍稀释。涂布：取0.1ml稀释菌液入平板中，用无菌涂布棒在培养基表面涂布均匀。合上皿盖，倒置培养皿于37培养24-36小时。挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板分离法进行纯化。（2）平板划线法：倒平板、培养和挑单菌落同A。划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三
17、条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。3、环境微生物的检验将1个牛肉膏蛋白胨平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基暴露在空气中，将另一牛肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。10min后盖上两个皿盖。1、无菌技术手和台面要消毒；无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；接种时接种环不要碰触试管口边，防止污染；棉塞不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住。倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养
18、基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；划线接种时，动作要轻，注意不要划破培养基；分离、接种时应严格按无菌操作要求进行；平板培养微生物时要倒置培养。六、实验结果1、记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。2、记录菌种分离培养的结果。七、思考题1、平板培养时为什么要把培养皿倒置？2、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？八、讲授重点1、倒平板2、微生物转接方法3、平板划线法和涂布平板法九、实验要求每位学生练习倒平板、液体试管接种、斜面接种、平板划线和涂布平板。十、考核点1、无菌操作是否规范2、平板划线方法是否正确实验三 显微镜的基本知识及使用方法附：数码显微镜的使用1
19、、掌握普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2、学习并掌握油镜的原理、使用方法、维护的基本知识。3、掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能。4、学习显微数码系统的使用方法。5、了解微生物在显微镜下的基本形态特征。现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成，在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率，而在普通光学显微镜通常配制的几种物镜中，油镜的放大倍数最高，但需要在载波片与镜头之间加滴镜油，主要是为了增加照明亮度和提高显微镜的分辨率。物镜放大倍数越大，焦距越短，直径更小，所需光强越大。从承载标本的
20、玻片透过来的光线，因介质密度不同，会发生折射或全反射使光线不能进入镜头。结果导致物像不清。在油镜和玻片间滴加与玻璃折射率（空气是1.55，香柏油是1.52）相近的镜油，使光线不会造成太大的损失。显微镜分辩率是显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小距离越小，分辨率越高。分辩率=/2NA=/2nsin（/2） 公式中可见光波长，平均为0.55m，n折射率（香柏油1.52，空气1.0，水1.33），NA是物镜的数值孔径，取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率。1、标本片：霉菌标本片、细菌（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等）的标本片（2片/组）。2、溶液和试剂：香柏油、乙醇乙
21、醚混合液或二甲苯等（各一瓶/组）。3、仪器或其他用具：普通光学显微镜（1台/组）、擦镜纸。（一）显微镜操作演示与录相1、观察前准备：镜座距实验台边缘约10cm，光源调节，调节目镜、调节聚光器数值孔径值。2、显微镜观察：（1）低倍镜观察（2）高倍镜观察（3）油镜观察一种方法是先低倍再高倍再油镜，使用微调节器聚焦。第二种方法是在低倍下找到样品区，用粗调节器升高镜筒，将油镜转到工作位置，在样品区滴加镜油后，从侧面注视用粗调节器小心降下镜筒，并使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径及视野照明亮度后，用粗调节器将镜筒徐徐上升，再用细调节器使聚焦清晰为止。后一种方法尽量不用，在实验中重点介
22、绍和使用第一种方法。3、 显微镜用毕后的处理：上升镜筒，取下载玻片；擦净镜油；清洁物镜及目镜；还原各部件，降下聚光镜。（二）Motic显微数码系统的使用 建文件夹： 例如 D:2008-2009学年环境0511班姓名图片要求：1）格式：JPG2）文件名：例如 环境0511班 姓名 大肠杆菌1000倍1、显微镜是精密仪器，在取放时要一手托住底座，一手握住镜臂，忌用单手拎提。2、养成双目观察的习惯，忌单眼观察。3、观察时可摘下近视镜或远视镜，因显微镜具有聚焦校正功能。若在观察时配载眼镜，应防止眼镜镜片与目镜镜片接触，以免造成镜片划痕。4、显微镜照明亮度的调节，可通过升降聚光器或改变光源亮度进行调节
23、，一般情况下聚光器都是调到最高位置。只要能获得良好的观察效果，也可以通过对虹彩光圈、聚光器高度、照明光源强度的协同调节灵活运用。5、使用粗节器聚焦物像时，必须养成的习惯是：先从侧面注视并小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本。否则可能因误操作而损坏镜头及玻片。6、一般情况下，可利用同焦现象，对在低倍镜下看到的物像，可以转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置，然后用细调节器对物像进行清晰聚焦，可以避免因使用粗调节器时可能发生的误操作而损害镜头或玻片。7、使用乙醇乙醚混和物或二甲苯等清洁剂时，不要过量使用或让其在镜头上停留时间过长，因清洁剂对镜头会造成损害。不能用手或滤纸擦镜头，
24、以免污染镜头或产生划痕。8注意区分待观察样品与使用时间较长的显微镜镜头上的霉点等污物。9每人在D盘上建一个文件夹，文件夹名与文件名的要求。低倍、高倍、油镜下观察微生物形态图1、用油镜观察时应注意哪些问题？2、在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？1、 显微镜结构2、油镜工作原理3、如何使用双目清晰观察物像4、聚光器数值孔径的调节5、利用物镜的同焦现象，如何配合使用低倍镜、高倍镜和油镜分别在不同物镜下获得清晰图像。6、使用注意事项，特别是油镜。7、数码显微镜系统软件的使用。1、练习使用显微镜，每位同学至少观察微生物的2个标本片（低倍、高倍物镜下观察霉菌，在低倍、高倍物镜、油镜下观察细菌），每一
25、类型的微生物至少观察一个标本片。2、用数码显微系统分别拍摄所观察到的微生物形态图，提交2张图片（高倍物镜下观察霉菌和油镜下观察细菌）。3、制成图版打印黑白图片，并标注菌种名称、观察物镜及总放大倍数。操作是否规范熟练以及油镜下的物像清晰度第三次实验（4学时，1人/组）微生物标本的制备与染色实验四 细菌的简单染色法1、学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。2、学习无菌操作技术。3、进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术。4、初步认识细菌的形态特征。细菌制片常采用涂片法，通过涂沫能使细菌细胞个体均匀分散在载玻片上，有利于观察个体形态。加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，能杀死大多数细菌但不会
26、破坏细胞形态。微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透和吸附作用等。化学因素：主要是正负离子之间的相互吸引。染色剂按染料电离后所在地带电荷的性质分为几种类型：酸性染料（如酸性复红，刚果红，伊红和苯胺黑等）、碱性染料（碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰等，细菌易被这种染料染色）、中性（复合）染性（伊红，美兰，Gimsa染料）。简单染色法是利用单一染料（如吕氏美蓝、碱性品红）对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料电离时的染色部分带正电荷，因此，碱
27、性染料的染色部分容易与细菌结合使细菌着色。在显微镜下因与背景有明显对比而易于识别。大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。2、 染色剂：碱性美蓝染液，石炭酸复红染液。显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。涂片- 干燥 - 固定 染色 水洗 干燥 - 镜检1、涂片：取干净载玻片，用记号笔做好标记，滴一滴生理盐水于载玻片中央；用接种环无菌操作分别挑取适量菌苔，沾有菌苔的接种环在载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（如果用液体培养物，
28、则用接种环蘸取1-2环菌液直接涂沫于载玻片上）。2、干燥：自然风干或用电吹风干燥。3、固定：细菌涂面朝上，通过火焰2-3次。4、染色：载玻片平放于桌面或载玻片支架上，滴加染液使之覆盖菌膜，一般染色1-2分钟。5、水洗：倾去染液，用自来水冲洗，水流宜缓，否则易冲掉细菌涂膜，至洗出的水无色为止。6、干燥：用吸水纸吸去多余水分，自然风干。7、镜检：制好的样片在显微镜下观察并记录。1、涂片时取菌量要适量，且要求涂布均匀。2、无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温使菌体变形。3、涂片需干燥后再加热固定，避免加热时间过长引起细胞易破裂或变形，以至载玻片破裂。加热固定时要用载玻片夹子或镊子，以免
29、烫伤。4、使用染料时注意避免沾到衣物和实验台面上。低倍、高倍、油镜下观察细菌形态图七、思考题 在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？1、 细菌简单染色的原理。2、 无菌操作与细菌涂片操作要点。3、 染色剂的类型与常用种类。4、 显微镜的使用。每位学生至少用一种染色剂对一株菌进行染色、观察、拍照。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。涂片质量与油镜下图像的清晰度实验五 细菌革兰氏染色法1、 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。2、 掌握革兰氏染色法操作技术。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱
