1、大肠杆菌和菌落总数所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方式是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在3724h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，要紧由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水中大肠菌群的查验方式，经常使用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各类水样的查验，但操作繁琐，需要时刻长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多
2、、易于阻塞滤孔的水样。(三)实验器材(1) 菌落总数的测定：1)培育基：牛肉膏蛋白胨琼脂培育基牛肉膏 g 蛋白胨 NaCl 水1000mL 将培育基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏经常使用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如略微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后当即掏出纸片。在上述烧杯中先假设少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的整体积。在未调pH前，先用周密pH试纸测量培育基的原始pH，若是偏酸，用滴管向培育基中逐滴加入1mol/L
3、 NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达。反之，用1mol/LHCL 进行调剂。无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是%：称取克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。2)器材试剂：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水 高压蒸气灭菌锅 培育皿 三角烧瓶 带玻璃塞瓶 天平 试管 牛角匙 pH试纸（） 棉花 记号笔 纱布 吸管 麻绳 牛皮纸 量筒 玻璃棒 电热炉 称量杯 灭菌三角瓶 灭菌的具塞三角瓶 灭菌平皿灭菌吸管 灭菌试管高压蒸气灭菌：1.将内层锅去向，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。2.放回内层锅，并加入要灭菌的培育
4、皿、试管、烧杯等物品（注意不要装得太挤，以避免防碍蒸气流通而阻碍灭菌成效）。3.加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4.本实验用，121.5，20min灭菌。灭菌所需时刻到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，掏出灭菌物品。 (2)大肠菌群的测定； 1)培育基： 乳糖胆盐蛋白胨培育基：蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，。 制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每
5、管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，l15灭菌15min。 双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培育基：除水之外，其余成份加倍或取三倍用量。 伊红美蓝琼脂培育基： 蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04 2g， 2伊红水溶液20Ml，美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，。 制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装121灭菌15min备用。临历时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 乳糖发酵管： 除不加胆盐外其余同乳糖胆盐蛋白胨培育基。 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。（四）实验方式 (1)水样的搜集： 1)
6、自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中掏出。若是不能在2h内检测的，需放入冰箱中保留。 (2)细菌总数的测定： 1)水样稀释及培育： 按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释： 依照对水样污染情形的估量，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一样选择一、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:10
7、00三种稀释度；污染水被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每一个稀释度作3个重复。 将熔化后保温度45的牛肉膏蛋白胨琼脂培育基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。 待琼脂凝固后，将平皿倒置于37培育箱内培育241h后掏出，计算平皿内菌落数量，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。 2)计算方式： 作平板计数时，可用肉眼观看，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。 3)计数的报告： 平板菌落数的选择： 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度利用
8、两个重复时，应选取两个平板的平均数。若是一个平板有较大片状菌落生长时，那么不宜采纳，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落散布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。 稀释度的选择：a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。 b假设有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，那么视二者之比如何来决定。假设其比值小于2，应报告其平均数；假设比值大于2，那么报告其中较小的数字(l例二、例3)。c假设所有稀释度的平均菌落均大于300，那么应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
9、(l例4)。d假设所有稀释度的平均菌落数均小于30、那么应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。e. 假设所有稀释度均无菌落生长，那么以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。 f. 假设所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，那么以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。 细菌总数的报告： 细菌的菌落数在l00之内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方式修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：表 1 稀释度的选择及
10、细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1042多不可计295463775038000或1043多不可计271602710027000或1044多不可计多不可计313-313000310000或105527115-270270或6000-10107多不可计30512-3050031000或1041)生活饮用水或食物生产用水的查验： 初步发酵实验： 在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培育液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜
11、氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。若是饮用水的大肠菌群数变异不大，也能够接种3份100mL水样。摇匀后，37培育24h。 平板分离： 经24h培育后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，别离划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培育基)上，37培育1824h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特点的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。 复发酵实验： 将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部份接于单倍乳糖发酵管中，为避免遗漏，每管可接种来
12、自同一初发酵管的平板上同类型菌落13个，37培育24h，若是产酸又产气者，即证明有大肠菌群存在。 报告： 依照证明有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。 2)水源水的查验： 用于查验的水样量，应依照估量水源水的污染程度选用以下各量。 严峻污染水：1，01，001000lmL各1份。 中度污染水：101，01，001mL各1份。 轻度污染水：100，10，1，01mL各l份。大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。表2 大肠菌群检索表（饮用水）012备注每升水样中大肠菌群数03411接种水样总量300mL（100 mL2份，
13、10 mL10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表3 大肠菌群数变异不大的饮用水阳性管数0123接种水样总量300mL（3份100 mL）每升水样中大肠菌群数341118表4 大肠菌群检索表（严峻污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1-900接种水样总量为（1，各一份）-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+23800
14、0表5大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注101-90接种水样总量为（10，1， mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230-+280+-+920+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大肠菌群检索表（轻度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注100101-9接种水样总量为（100，10，1，各一份）-+9-+-9-+-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7 大肠菌群变异不大的水
15、源水阳性管数012345678910每升水样中大肠菌群数10112236516992120160230230备注接种水样总量100mL(10mL10份)操作步骤同生活用水或食物生产用水的查验。同时应注意，接种量1mL及1mL之内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培育液量。然后依照证明有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表107-4、表l07-五、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。 附：滤膜法 滤膜法所利用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，通过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大
16、肠菌群选择性培育基上进行培育。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。 (1)预备工作： 1)滤膜灭菌：将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于滚水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。 2)滤器灭菌：预备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121高压灭菌20min。 3)培育：3）培育：将品红亚硫酸钠培育基放入37培育箱内预温30-60min。 (2)过滤水样： 1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部份，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，
17、加盖，打开滤器阀门，在50kPa压力下进行抽滤。 2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部份，移放在品红亚硫酸钠培育基上，滤膜截留细菌面向上与培育基完全紧贴，二者间不得留有间隙或气泡。假设有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37培育箱内培育16-18h。 (3)结果判定： 1)挑选符合以下特点的菌落进行革兰氏染色，镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡红色，中心颜色较深的菌落。 2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培育基，37培育6-8h，产气者，那么判定为大肠菌群阳性。 3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3
