1、置35孵育箱孵育1618h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育24h。 4结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域），当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌，在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长，生长层小于20可忽略不计。根据CLSI/NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式
2、（敏感/中度敏感/中介、耐药）。 （二）稀释法 如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量（浓度）的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法（dilution method）。稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀释法，分别介绍如下： 1肉汤稀释法 有常量稀释法（mac-rodilution）和微量稀释法（microdilution），前者含药肉汤含量每管l.0ml（通常2m1），后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后
3、应校正pH值为7.27.4（25）。离子校正的M-H肉汤（CAMHB）为目前推荐的药敏试验培养液。（2）药物稀释药物原液制备：抗菌药物直接购自于厂商或相关机构，所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。质量（mg）=溶剂（ml）浓度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容积（m1）= 质量（mg） 分析效能（ug/mg）/浓度（ug/ml）配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH值为6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。 一般原液浓度不低于1 000ug/ml或10倍于最高测试浓度，原液应储存于-60以下，保存期不超过6个月。稀释抗菌药物的制备：行2倍系列稀释，使其终浓度（ug
4、/m1）为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。 （3）菌种接种：配制05麦氏浓度菌液，用肉汤（常量稀释法）、蒸馏水或生理盐水（微量稀释法）稀释菌液，使最终菌液浓度（每管或每孔）为5105 CFUml，稀释菌液于15min内接种完毕，35孵育1620h，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为2024h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满24h以上。 （4）结果判断：以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（ug/m1）。甲氧苄啶（甲氧苄胺嘧啶）或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断，以细菌
5、数为阳性对照的80即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。 2琼脂稀释法 琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。M-H琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基，调整pH值在7.27.4（25），过高或过低的pH值会影响药物效能。 （2）含药琼脂制备：将已稀释的抗菌药物按1：9（配制的药物溶液：琼脂培养基）加入，加热溶解琼脂，在4550水浴平衡融化MH琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为34mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中，置28，储存日期为5
6、d，对易降解药物如含头孢克洛，在使用48h之内制备平板，使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中30min以使琼脂表面干燥。 （3）细菌接种：将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍，以多头接种器吸取（为12ul）接种于琼脂表面，稀释的菌液于l5min内接种完毕，接种后置35孵育1620h（MRS、VRE孵育时间需满24h），奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长）。试验菌的结果报告可用MIC（ug/mg）或用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。 （三）E
7、试验 E试验（Epsilometer test）是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。 1试验原理 E试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判断有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。2细茵接种和加样使用厚度为4mmM-H琼脂平板，
8、用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。采用CLSl/NCCLS AST执行标准推荐孵育条件。 3结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。E试验IC值与CLSl/NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关，二者直接相对应，CLSl/NCCLS MIC折点值适用于E试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。二、苛养菌的药物敏感试验 肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通MH
9、培养基中快速生长，上述的药敏试验条件不适合它们。它们需要更为复杂的培养基、孵育条件，在进行药敏试验时，质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。各自的结果判断标准请参考CLSl/NCCLS手册。 （一）嗜血杆菌属 1试验条件使用嗜血杆菌属试验培养基（hemophilus test medium，HTM）。 （2）接种菌液：菌悬液终浓度为5105CFU/ml。 （3）孵育条件：35下孵育2024h观察结果。对于扩散法，35、57C02下孵育l618h观察结果。 2质量控制 流感嗜血杆菌ATCC49247、
10、流感嗜血杆菌ATCC49766、大肠埃希菌ATCC35218（用于-内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂）为推荐参考菌株。 3结果判断注意事项 （1）血液、脑脊液分离株仅需做氨苄西林、三代头孢菌素中的一种、氯霉素和美罗培南。 （2）耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产TEM型-内酰胺酶。大多数情况下，直接检测-内酰胺酶更快。 （3）-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药（-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR）的流感嗜血杆菌株少见。然而，不论其体外药敏试验是否出现敏感，均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西
11、林/他唑巴坦耐药。 （二）肺炎链球菌肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。菌悬液终浓度为l05CFU/ml。35下孵育2024h。 2质量控制 肺炎链球菌ATCC49619、大肠埃希菌ATCC35218（用于-内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂）为推荐参考菌株。 （1）对青霉素敏感者，均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感；青霉素中介或耐药株，不推荐做上述药物的药敏试验，因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。应当及时通知临床医生，然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南的MIC。 （2）静脉注射高浓度青霉素（肾功能正常的成人
12、2106U/4h）或氨苄西林（29/6h）对青霉素中介的肺炎链球菌是有效的。标准剂量的头孢曲松、头孢噻肟对中介的肺炎链球菌也有临床疗效，但在发现该菌株引起的脑膜炎时常用最大剂量治疗。 （三）肺炎链球菌外链球菌属肉汤稀释法同肺炎链球菌，琼脂稀释法用含5羊血琼脂。琼脂稀释法需5C0。 2质量控制 肺炎链球菌ATCC49619为推荐质控菌株。 （1）化脓性链球菌一般不需做青霉素药敏试验，该菌目前对青霉素仍为敏感株，只有某些无乳链球菌可能会对青霉素产生中介结果。 （2）对青霉素敏感的链球菌，同时被认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头
13、孢唑肟等敏感，毋需对这些抗生素进行药敏试验。 （3）青霉素或氨苄西林中介的菌株，需用氨基糖苷类联合用药进行治疗。（4）对红霉素耐药者或敏感者常提示对阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素耐药或敏感。三、分枝杆菌的药物敏感试验 （一）结核及慢生长分枝杆菌的药物敏感试验 由于结核及慢生长分枝杆菌生长缓慢，在生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故不适用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验。结核及慢生长分枝杆菌药敏试验的药敏培养基、含药浓度、接种菌量、结果解释等都有其特殊性。 比例法是WH0/IUATLD全球结核病耐药监测方案中推荐的方法，目前国外普遍采用此法。国内多采用绝对浓度法，据报道，该法比比例法的
14、耐药菌检出率要低510。某些微生物自动鉴定和药敏系统则采用放射核素等方法。 1绝对浓度法（absolute concentration method）该法以“无生长”为终点或为最低抑菌浓度（MIC）来判断耐药与否，每种药物需制备两种不同浓度的含药培养基，同时用不含药培养基作为对照，接种菌液最终浓度为1ug/ml，37培养4周观察结果。判断标准为对照培养基上细菌生长良好，含药培养基上菌落20个判为耐药。 （1）试验条件培养基：改良罗氏培养基（Lowenstein-Jensen，L-J）。试验药物：试验用药物和药物浓度（表6-2）。接种菌液：多点刮取培养物少许，置于磨菌器中，用磨菌捧捻磨，使呈乳酪
15、样，以0.5Tween-80生理盐水稀释，与比浊管比浊，配制成lmg/ml菌悬液，然后以灭菌生理盐水稀释至l0-2mg/ml。试验时每点接种lOOul。孵育条件：37下孵育4周。（2）质量控制：结核分枝杆菌H37RvATCC 27294为一线、二线药的敏感质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35822为异烟肼耐药质控菌株；结核分枝杆菌K37Rv ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35828为吡嗪酰胺耐药质控菌株；结核分枝
16、杆菌H37Rv ATCC35830为乙硫异烟胺耐药质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35837为乙胺丁醇耐药质控菌株；结核分枝杆菌H37Rv ATCC35838为利福平耐药质控菌株。 （3）结果判断注意事项：每周阅读平板1次。根据CLSI/NCCLS药敏测定时间，结核分枝杆菌为3周，慢生长分枝杆菌为2周，到4周末终止培养。结果报告方式分敏感、低浓度耐药、高浓度耐药和实报菌落数4种。判断标准如下：敏感。含药培养基上无菌落生长。低浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落数20个，高浓度含药培养基上无或极少菌。高浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落茂盛，高浓度含药培养基上菌落数20个（+菌落数约占斜面面
17、积l/4；+菌落数约占斜面面积l/2；+菌落数约占斜面面积3/4；+菌落呈菌苔样生长）。实报菌落数。低浓度含药培养基上菌落数20个时，实报菌落个数。 2比例法（proportional method） 此法是在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液，以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。 （1）试验条件：培养基Milddle brook7H10琼脂。试验药物。在表6-2中列出了CLSI/NCCLS推荐的抗结核分枝杆菌比例法药敏试验用药物和药物浓度。接种菌液。调整细菌浓度为1麦氏浓度，再将其用7H9肉汤稀释成102和104倍两种浓度。分别吸取两种不同浓度的菌液l0u
18、l（标准接种环一接种环）接种于同一个浓度的含药培养基及对照培养基。孵育条件。 （2）质量控制：基本同绝对浓度法。在两个浓度梯度的平板中，计数易数出菌落数的那一个，与对照平板菌落数相比，算出耐药百分比。 3放射核素法BACTECTB 460等仪器检测系统使用放射核素法进行快速检测。具体使用见产品说明书。 （二）快速生长分枝杆菌的药物敏感试验 快速生长分枝杆菌在合适的固体培养基上孵育57d肉眼可见细菌菌落生长。其药物敏感试验常以肉汤稀释法进行，操作方法基本同需氧和兼性厌氧菌。菌种用胰大豆肉汤或CAMHB加上0.02Tween-80，以避免细菌的聚集。30孵育35d后观察结果。四、厌氧菌的药物敏感试
19、验 由于厌氧菌对目前常用抗生素的敏感性较为稳定，加之厌氧菌培养要求特殊，临床实验室一般不做体外药敏试验。发生下述临床情况时应考虑体外药敏试验：明确厌氧菌引起的严重感染；已确诊的厌氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏效；需长期用药的厌氧菌感染。 厌氧菌体外药敏试验基本原理和方法与需氧菌相同，只是培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。 1培养基采用布氏血琼脂（Brucella blood agar）。配制完毕的布氏血琼脂储存期不能超过7d（4l0），最好不能长于72h。含亚胺培南和克拉维酸的培养基必须使用当天制作平板。布氏心脑浸液加入35冻融羊血为稀释法培养基。 2孵育条件 厌氧箱和
20、厌氧罐是必需配置的，气体条件为80N2、l0H2和l0C02，还需加入冷催化剂钯粒和亚甲蓝指示剂，3537孵育48h。3.质控菌株 脆弱类杆菌ATCC25285、多型类杆菌ATCC 29741、迟缓优杆菌ATCC 43055。五、抗菌药物敏感试验的质量控制 抗菌药物药敏试验必须做有效的质量控制，以保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性。要完成有效的药物敏感性试验，除了必须采用可靠的试剂和检测系统外，实验室应建立一套完善的操作流程和评价程序，以规范试验中使用的各种试剂，规范操作者的操作和对结果的判断。 （一）质量控制参考菌株的质控试验 除了阳性生长对照试验、纯度对照试验、接种量对照试验、结果终点
21、判读对照试验等外，临床微生物室常通过对已知的抗生素敏感的菌株进行测试，以达到综合质量控制目的。 CLSI/NCCLS 2004 AST执行标准推荐下述参考菌株为稀释法MIC的测定：金黄色葡萄球菌ATCC 29213，金黄色葡萄球菌ATCC 43300，肺炎链球菌ATCC 49619，粪肠球菌ATCC 29212，粪肠球菌ATCC51299，淋病奈瑟菌ATCC 49226，大肠埃希菌ATCC 28922，大肠埃希菌ATCC 35218，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，铜绿假单胞菌ATCC 27853，流感嗜血杆菌ATCC 49247，流感嗜血杆菌ATCC 49766。 一般来说，这些菌株同样
22、也适用于琼脂扩散法。金黄色葡萄球菌ATCC 25923只用于琼脂扩散试验。大肠埃希菌ATCC35218仅推荐用于含-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦的抗生素）药敏试验；金黄色葡萄球菌ATCC 43300和29213使用于苯唑西林盐琼脂筛选试验；粪肠球菌ATCC51299和29212使用于万古霉素筛选试验和高水平耐氨基糖苷类肠球菌药敏试验；肺炎克雷伯菌700603使用产ESBLS的试验。 质控菌株需用临床分离株相同的培养基和方法进行标准法的药敏试验。CLSI/NCCLS质控菌株的MIC预期值和抑菌圈直径参见CLSI/NCCLS手册。质控菌株稀释法药敏试验的MIC应位于整个试验浓度范围
23、的中部。 储存质控菌种应在菌种保存液（50胎牛血清肉汤或10l5胰大豆肉汤）中置于-20或-80或液氮中，也可冷冻真空保存。冻存的或冷冻真空的培养物至少在试验前需传代2次。工作中的质控菌株在胰大豆琼脂（一般菌）或巧克力琼脂（苛养菌）斜面上每周传代一次。在试验前传代的菌株应在琼脂平板上分离取得单个菌落。 质控试验应每日进行。MIC在预定值范围外时，需查找误差原因并予以纠正。产生误差的原因包括：质控菌株选用不当；细菌菌液浓度不对；培养基储藏不当或过期失效；质控菌株或培养基被污染；培养基平板的制作不符合要求；孵育的温度和气体条件不符。 （二）药敏试验平板、肉汤的质量控制 常量稀释法的含药肉汤试管、微
24、量稀释法的条板和稀释琼脂平板在使用前均应进行合适质控菌株的测试，观察其MIC是否在预期值范围，不在预期值范围内者应丢弃。当然，上述培养基应做无菌试验，至少每批抽样一支，孵育过夜，观察细菌有无生长，以确保培养基无菌。 MH琼脂可用铜绿假单胞菌ATCC227853作为质控菌株，用10ug含药的庆大霉素纸片做药敏试验，其抑菌环直接应在CLSI/NCCLS AST执行标准预定值范围内。六、耐药性监测的分子遗传学 随着分子细菌遗传学和分子生物学技术的不断进步，微生物对抗生素耐药性的遗传学机制不断明了，许多用于检测抗生素耐药性的基因检测方法，如PCR、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP分析、PCR-S
25、SP、基因芯片分析、DNA序列测定等，得以发展并在临床实验室应用。 与常规方法相比，基因检测方法检测抗生素耐药基因有下述优点：有些细菌不能或不易培养，只能检测其基因型；能快速鉴定慢生长细菌的耐药性，能早期指导临床医生治疗用药；有助于判定MIC位于折点或折点附近的细菌药敏试验结果；在细菌耐药性的流行病学追踪调研中，基因检测比抗生素药敏方法准确。 当然，目前抗生素耐药性的基因检测方法尚处于发展早期。既没有完全弄清细菌耐药的遗传学机制，也没有建立起检验标准。基因检测药敏试验的主要不足在于：细菌对同一抗生素的耐药通常可由多种耐药机制引起，基因检测方法通常只能检测某一特定的耐药，而抗生素药敏试验则能用一
26、种培养分析检测不同形式的耐药。 1-内酰胺药物耐药基因的检测 （1）耐苯唑西林金黄色葡萄球菌基因的检测：苯唑西林MIC值为28ug/ml被判为MRsA（耐苯唑西林金黄色葡萄球菌）的金黄色葡萄球菌可能具有mecA基因，也可能是因为产高水平-内酰胺酶，以至缓慢水解苯唑西林。临床治疗MRSA引起的感染首选万古霉素，而治疗产高水平-内酰胺酶菌株所致感染，则应使用对酶稳定的-内酰胺类药物或-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂合剂。 （2）肺炎链球菌-内酰胺耐药基因的检测：肺炎链球菌可获取其他肺炎链球菌或其他链球菌染色体DNA而修饰自身PBP（青霉素结合蛋白）导致耐药。PBP2b基因序列（该序列仅出现于青霉素敏感菌
27、株）的PCR阴性则提示可能介导耐药。 （3）革兰阴性菌-内酰胺基因的检测：编码革兰阴性菌中的TEM、SHV、OXA等-内酰胺酶的基因的DNA探针和PCR引物已能合成，可用于基因检测方法检测。还可采用等电聚焦电泳和DNA测序作为鉴定新的-内酰胺酶基因的筛选工具。 2氨基糖苷类耐药基因的检测 革兰阴性细菌具有多种不同类型的耐氨基糖苷类耐药基因，如转乙酰基酶、转腺苷酶和转磷酸基酶编码基因。目前为止，尚无一种DNA探针或PCR引物预测它们的耐药性。 革兰阳性细菌对氨基糖苷类的耐药性较单一，通对DNA和PCR方法可检测出氨基糖苷类高水平耐药基因，如检测肠球菌ant（6）链霉素耐药基因和编码庆大霉素耐药的
28、aac（6）-aph（2）基因。 3大环内脂、林可霉素、米卡霉素（密柑霉素）耐药基因的检测 mefA和mefE为大内脂类抗生素泵出基因。肺炎链球菌耐红霉素，常由mefE基因介导。红霉素甲基酶基因（erm）介导大环内酯类、林可霉素和米卡霉素耐药。msrA基因仅介导对大环内脂类和米卡霉素耐药。msrA的PCR分析法可判定是存在msrA还是crmA，以辅助是否可选用氯洁霉素治疗耐红霉素葡萄球菌感染。 4喹诺酮耐药基因的检测 喹诺酮耐药的两大主要机制为：靶位改变。DNA解旋螺旋酶（由gyrA和gyrB编码）和拓扑异构酶（由parC和parE编码）改变；药物主动泵出。耐药常与9yr和par位点突变相关。PCR技术扩增后测定gyrA、parC和parE基因的核酸序列有助于检测对喹诺酮的耐药性。 5糖肽类耐药基因的检测 肠球菌耐药性有几种不同的基因，包括vanA、vanB、vanCl、vanC2、vanC3、ranD等，检测上述基因的DNA探针和PCR方法已有报道。日本、美国还报道了对糖肽类抗生素敏感性降低的金黄色葡萄球菌，由于耐药机制不清，目前尚未有相应的基因检测方法。 VanA型对万古霉素和替考拉宁均高度耐药，Van
