1、分子生物学实验指导分子生物学实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。实验目的 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。实验原理植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA
2、进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下， 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都
3、有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/2801.8，纯的RNA样品A260/2802.0，并且1g/ml DNA溶液A260=0.020。实验器材1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料实验试剂1、3CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris 25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% -巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L TrisHCl1mmol
4、/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮 实验步骤1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4下8000rpm离心10min。6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根
5、据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。8、小心取下这些纤维状沉淀，加12 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。9、将粗制品溶于TE缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。实验结果第一组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.022，A280=0.012，A260/2801.83第二组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样
6、品DNA溶液A260=0.020，A280=0.011，A260/2801.81第三组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.024，A280=0.013，A260/2801.84 注意事项1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。思考题CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？液氮研磨的原理是什么？实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂
7、有较强的抵抗力。在pH4.0-9.0 的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它
8、们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA
9、，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA, 简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。实验器材1、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、DNA marker4、检测样品5、琼脂糖实验试剂1、5TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5TBE：Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）2、凝胶加样缓冲液（6）溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%3
10、、溴化乙锭溶液（EB） 0.5g/ml实验步骤（一）制备琼脂糖凝胶1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-42.0 0.1-32、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（二）胶板的制备1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2、有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子
11、。3、将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。（三）加样用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（四）电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，染色30min。4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。实验
12、结果观察到较为明显的条带，分子量大的条带落后。注意事项因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005实验三 PCR基因扩增PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的聚合酶链反应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。实验目的学习和掌握PCR反应的基本原理与实
13、验技术。实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1、变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3、延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述
14、3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。实验器材1、PCR热循环仪2、tip头、冰盒3、PCR管4、超纯水5、DNA相对分子质量标准物6、移液枪实验试剂1、10缓冲液 500mmol/l KCl 100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室温) 15mmol/l MgCl2 0.1% 明胶2、4dNTP 1mm
15、ol/l dATP 1mmol/l dCTP 1mmol/l dGTP 1mmol/l dTTP3、Taq酶 5U/L4、DNA模板 1ng/L5、引物1 、引物2 引物溶液浓度 10pmol/l实验步骤1、在PCR管内配制20L反应体系：反应物 体积/L10buffer 2.0dNTP 1.0引物1 1.0 引物2 1.0 Taq酶 0.5Template 1ddH2O 13.5总体积 202、按下列程序进行扩增：、95预变性 5min、95变性 1min、55退火 1min、72延伸 1min、重复步骤30次；、72延伸 10min3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取
16、10L扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。实验结果紫外灯下能明显看到条带。注意事项1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。2、取样时注意不要污染药品。思考题1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的原因是什么？2、PCR仪的热盖设置有什么优点？参考文献1、PCR技术操作和应用指南 主编 林万明 人民军医出版社 1995年2、PCR技术实验指南美C.W.迪芬巴赫 G.S.德维克斯勒 科学出版社 2003年实验四 目的基因片段与克隆载体质粒的连接仪器设备：低温水浴锅、冰箱、T4连接酶、外源DNA与酶切的载体等。实验目的：重组DNA连接及鉴定重组子的方法
17、。基本要求：学会按一定比例用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应。实验原理及步骤：外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做 重组子。重新组合的DNA分子是在连接酶的作用下进行连接的。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。连接反应总体积为10L，体系组成如下：回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0L10Ligation buffer1.0LT载体（10ng/L）1.0LT4 DNA ligase1.0L共10.0ul混均后，4连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。转化操作方法1）取一管-80保存的感受态细胞，置冰上融
18、化；一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例：2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；3）将离心管置于42热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管；4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50
19、 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）实验结果培养板上有已转化的菌斑生成。注意事项：1、感受态细胞应保存在-70，不可多次冻融和放置时间过长
20、，以免降低感受态细胞的转化效率。2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。4、氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL。实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内
21、切酶和甲基化酶的突变体(R，M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。实验目的学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培
22、养基上。实验器材1、超净工作台2、低温离心机3、恒温摇床4、恒温箱5、恒温水浴器6、ppendorf管、Tip头7、转化的目的质粒8、大肠杆菌菌株DH59、试管、培养皿、锥形瓶实验试剂1、1mol/l CaCl2溶液（高压灭菌）2、LB液体培养基 配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入： 胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g 酵母提取液（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积1L，121湿热灭菌20 min。3、LB固体培养基1000ml加15g琼脂。4、氨苄青霉素（Amp），
23、用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20冰箱保存。实验步骤1、从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。2、取0.5ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中，37振荡培养23 h。（此时，OD6000.40.5，细胞数务必108/ml，此为实验成功的关键）。3、吸菌液1ml加入Eppendorf 管，10,000rpm离心15sec回收细胞。4、用冰预冷的0.1mol/l CaCl2500L悬浮沉淀。5、再离心15 sec（10000rpm），回收细胞。6、再用冰预冷的0.1mol/l CaCl260L重悬沉淀。7、在-4下可保
24、存2周（24 d时，转化效率最高）。此细胞为感受态细胞。8、同时做两个对照管：受体菌对照：60L 感受态细胞 + 2L 无菌水质粒对照：60L 0.1mol/L CaCl2溶液 + 2L 质粒DNA溶液9、将管放到42循环水浴12min。10、冰浴2min。11、每管加800L LB液体培养基，37培养1 h（慢摇）。12、将适当体积（200L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。13、倒置平皿37培养1216 h，观察细菌生长情况。实验结果在含有氨苄青霉素的培养皿中有菌斑生成注意事项1、超净上无菌操作注意安全。2、实验过程中尽量避免杂菌污染。思考题1、CaCl2制备感受态的可能
25、原因是什么？2、如果平板培养后出现卫星斑的可能原因是什么？3、如何提高转化的效率？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005部分试剂配法：配制1MTris-HCl（中文名：三羟甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，缓血酸铵）, pH8.5， 500ml ，配法是：60.55g Tris + 400ml H2O + 约20 ml 浓HCl，pH调至8.5，定容至500ml.EDTA标准溶液的配制与标定 1.EDTA标准溶液的配制（约0.02molL-1） 称取2.0g乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y2H2O）溶于250mL蒸馏水中，转入聚乙烯塑料瓶中保
26、存。 2.EDTA标准溶液浓度的标定 用20mL移液管移取Mg2+标准溶液于250mL锥形瓶中，加入10mL氨性缓冲溶液和34滴EBT指示剂，用0.02molL-1EDTA标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为蓝色即为终点。平行标定3次。1）2CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巯基乙醇。即称取CTAB 2 g加蒸馏水40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100ml（提取前加入2%的巯基乙醇，100ml
27、加0.2ml巯基乙醇） 2）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris碱；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml 3）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml水中加入18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml 4）5M NaCl 100ml：称取29.22g NaCl，用ddH2O定容到100ml 5）3M NaAc10ml：称取2.46g NaAc，用ddH2O定容到10ml 操作步骤： 1、 称取1.0g幼
28、嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入1.5ml离心管中，加入600 ul 65预热的CTAB溶液（用前加入2%的巯基乙醇） 2、 将装有CTAB和样品的EP管放入65水浴，约1h 3、 冷却后，加入600ul 的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离心15min 4、 吸上清，装入一新的EP管 5、 加入600ul 氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。离心15min 6、 吸上清，转入一新的离心管中，加入1/3体积的NaAc（3mol/l） 7、 加入1ml-20预冷的无水乙醇，混匀后置于-20（-80，30min）3-4h 8、 12000rpm，10min弃上清 9、向离心管中加入75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干 10、加入ddH2O（10-20ul）溶解 药品：Tirs碱、浓盐酸、EDTANa2.2H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇 研钵、恒温水浴、离心机、离心管
