1、 根据Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：4.2.1.2 cDNA第一链合成同3.2.6提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：表3-1 cDNA第一链合成体系及操作过程Table 3-1 RevertAidTM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol反转录合成cDNA第一链总RNA1.5 LPrimer：Oligo（dT）18 primer1 LDEPC处理水9.5 L轻微震荡混匀，65孵育5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：
2、5反应缓冲液4 LRiboLockTM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/L）10 Mm dNTPs混合物2 LRevertAidTM M-MuLV反转录酶（200 u/L）瞬时离心收集反应液，25孵育5min，42孵育60min；70 5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20存放备用。4.2.1.3 SOCS2基因编码区（CDS）的扩增依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列（NM_007706.3），用Primer Premier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。表4-1 SOCS2
3、CDS区扩增引物Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequencePrimer namesPrimer sequence （5-3）SOCS2-F：CGTGTTGACTCATCTCCCSOCS2-RCATAGCTGCATTCGGAGASOCS2-F-BglGCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGGSOCS2-R-Flag-XhoGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩
4、增体系和条件扩增SOCS2 CDS区。表4-2 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件Table4-2 PCR amplification system and 10PCR 缓冲液1.25 LdNTP Mixture（各 2.5 mM）上、下游引物（10M）各0.5 LcDNA1.3 LddH2O7.45 L瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：预变性（95）5min反应一：（20个循环）变性（95）40s退货（62，每个循环降0.5，共20循环）延伸（72）50s反应二：退火（57）反应三：8min反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4，-20可存放一周4.2.1.6 SOCS2
5、CDS区的 T载体克隆及鉴定 依照Takara pMDTM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2 CDS全长克隆至pMDTM18-T；A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；pMD18-T（50 ng/L）插入的目的片段（0.1-0.3 pmol）3.5 LdH2O 0.5 LSolution5 LB. 瞬时离心，收集反应液。16孵育过夜（12 h）；将连接产物10 L加入到100 L DH5感态中，冰浴30 min；C. 42热击45s，迅速冰浴1 min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；D. 加入1 mL LB无抗性培养液，37、200
6、rpm震荡培养1 h；E. 室温、4000 rpm离心5 min，收集菌体；吸弃900 L培养液上清，用枪头吹打100 L余液，重悬菌体；F. 无菌条件下，将100 L菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37倒置培养；E. 培养约12 h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37、250 rpm震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；阳性克隆送至金斯瑞公司测序。4.2.2 DH5感受态的制备（CaCl2）无菌条件下，将冻存的DH5划线接种于无抗性的LB固体平板上，37 倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100 mL无抗性的LB液体培养液中，于37、250 rpm，震
7、荡培养过夜（约16 h）；A.从中吸取1 mL菌液接种于100 mL无抗性的新鲜培养液，37、250300 rpm培养23 h，从2 h开始不断对菌液测OD=600值，直至0.4OD=6000.6（0.45为最适OD值）；B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1M CaCl2和含1520%甘油的0.1M CaCl2需要预冷处理；C.取30 mL菌液于50 mL离心管，冰上冷却10 min；D.4 4500 rpm离心5 min收集菌体；加3 mL 0.1M CaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20 min；E. 4 4500 rpm离心5 min，收集菌体；加3 mL含1520%
8、甘油的0.1M CaCl2，枪头吹打混匀菌体；每100 L分装一管，-80 冻存。4.2.3 质粒转化A. -80冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；B. 向100 L感受态中加入连接产物（含量50 ng，体积10 L），摇匀，冰上静止30 min；C. 42 水浴热激90 s，或37水浴5 min，热击后迅速置于冰上，静止5 min；操作过程不要有激烈摇动；C. 向离心管中加1 mL 无抗性LB培养基，混匀后，37 250 rpm振荡培养1 h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；D. 将上述菌液4000 rpm离心5 min，弃去1 mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的
9、LB固体平板，放置30 min后，37倒置培养过夜。4.2.4 质粒的小量提取挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37 300 rpm激烈振荡培养1216 h，获得的新鲜菌液依照Omega E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。4.2.5 重组穿梭穿梭质粒的构建4.2.5.1 SOCS2 CDS区的PCR扩增和回收以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-Bgl和SOCS2-R-Flag-Xho分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点（下
10、划线部分）和Flag标签（斜体部分）。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。 4.2.5.2 SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行Bgl和Xho的双酶切，穿梭质粒酶切体系：BufferpAdTrack-CMV（0.51 g/L）6 LBgl0.6 LXhodH2O10.8 LSOCS2 PCR产物酶切体系 ：SOCS2 11 L15 L瞬时离心收集反应液，37孵育5 h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步
11、骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。4.2.5.3 SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：2.5 LSOCS2 CDS（约0.3 pmol）5.5 LCMV（约0.03 pmol）0.7 LT4连接酶（350U/L）15.3 L瞬时离心收集反应液，16孵育过夜，取10 L连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5感受态，于含Kan（100 g/mL）的固体LB平板，37倒置培养过夜。挑取生长良好的单克隆，于含15 mL Kan（100
12、 g/mL）的LB液体培养基，37摇菌过夜，培养液浑浊后，取800 L菌液甘油（1520%）冻存备用，其余用于穿梭质粒提取和后期检测。4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定取10 L单克隆摇菌获得的菌液，用无菌水稀释至100 L，以0.5 L稀释后的菌液为模板，用SOCS2 CDS区的扩增引物为检测引物，按照SOCS2 CDS的扩增参数和体系见表1，进行PCR扩增。产物用1%琼脂糖凝胶检测，凝胶成像观察，依照扩增片段的大小，对挑取的单克隆做初级筛选，以备后续参考。4.2.5.5 重组穿梭质粒的小量提取选取初级筛选正确的单克隆菌液，取5 mL依照4.2.4步骤小量提取穿梭质粒。4.2.5.6
13、 重组穿梭质粒的鉴定和测序A. PCR鉴定: 用无菌水10倍稀释提取的重组穿梭质粒，取0.5 L作为模板，用SOCS2 CDS区的扩增引物为检测引物，按照表4-1 SOCS2 CDS全长扩增的反应体系及参数进行PCR检测。取5 L PCR产物进行琼脂糖凝胶检测，依照扩增片段的大小鉴定SOCS2是否与重组质粒连接。鉴定正确的质粒用将酶切鉴定。B. 酶切鉴定：重组质粒PCR鉴定正确的质粒，进行Bgl和Xho双酶切鉴定，体系：重组质粒（0.51 g/L）Xho I BufferH2O11.8 L瞬时离心收集，37酶切5 h，酶切产物取5 L，与2 L上样缓冲液混匀，于1%琼脂糖进行电泳检测，依照Ma
14、rk大小判断是否酶切出大片段pAdTrack-CMV，和小片段SOCS2。C. 选择PCR与酶切鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序结果与GenBank所公布的序列一致的，命为pAdTrack-CMV-SOCS2。4.2.6 pAd-SOCS2的构建4.2.6.1 E.coli BJ5183及含pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183感受态的制备A. E.coli BJ5183感受态制备：将-80冻存的E.coli BJ5183菌株，划线于含链霉素（3050 g/mL）的LB平板，37倒置培养1216 h，如果菌液冻存时间过长，有必要进行二次活化，即挑取单克隆二次划线，最终获
15、得的单克隆摇菌培养，CaCl2法制备感受态，具体步骤见4.2.2.B. 含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态制备：依照4.2.3步骤将pAdEasy-1质粒转化于BJ5183感受态，涂于含Amp（100 g/mL）的LB平板，挑取单克隆于含Amp（100 g/mL）的液体LB培养基，待菌液浑浊后，同样用CaCl2法获得含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态，步骤见4.2.2。4.2.6.2 Pme酶切线性化pAdTrack-CMV-SOCS2 和CIAP去磷酸化小量提取质粒法获得质粒pAdTrack-CMV-SOCS2，用Pme酶切线性化，体系如下：SOCS2重组质粒（4 g）2
16、5 L100BSA10 L内切酶双蒸水62 L离心收集，37温浴8 h，CIAP处理Pme单酶切的质粒，使其去磷酸化防止自我环化，体系如下：线性化质粒60 L（120 pmol）CIAP 26 LA. 酶切反应：37或50水浴30 min，B. 抽提1：加100 L有机溶液混合物（苯酚：氯仿：异戊醇比例为25:24:1），用手激烈摇动，使溶液成为乳浊液，12,000 rmp离心6 min，取上清液；重复此步骤一次；C. 抽提2：加等体积（约100 L）的有机混合物（氯仿：异戊醇比例为24:1），摇动成乳浊液，离心后取上清；D. 乙醇沉淀：加10 L即上清1/10体积的NaOAC（3M），250
17、 L即上清2.5倍体积的-20预冷乙醇，-20冷浴1 h；E. 收集和洗涤沉淀：12000 rpm离心12 min；加200 L冷乙醇（70%）洗涤沉淀，12000 rpm离心6 min；F. 干燥、溶解核酸：将离心管倒置于滤纸，待管内酒精挥发后，用30 L无菌双蒸水溶解沉淀，冻存备用。4.2.6.3 线性化的重组质粒与骨架质粒重组取一管-80冻存的BJ5183感受态，室温溶化后迅速置于冰上，加10 L线性化的质粒到感受态细胞中，冰上静止30 min，热击法将线性化质粒转化如BJ5183与骨架质粒pAdEasy-1进行重组，详细步骤见4.2.3。转化产物涂于含Kan（100 g/mL）的 LB
18、平板，37培养约20 h。4.2.6.4 重组质粒的筛选和初级鉴定重组质粒筛选：生长20 h的平板上可以观察到大小不一的菌落，挑取较小的菌落接种于15mL含Kan（100 g/mL）的液体培养基，37振荡培养，菌液浑浊后，取800 L菌液加200 L 80%甘油-80冻存，其余菌液用作后续鉴定。重组质粒的初级鉴定即菌液PCR，步骤同4.2.6.4。4.2.6.5 重组质粒的小量提取取5 mL初级筛选正确的菌液，依照小量提取质粒的方法提取质粒，具体步骤见4.2.4。获得的质粒微量定量仪测定浓度，以备后续使用。4.2.6.6重组质粒的鉴定和测序A. 质粒PCR鉴定：同4.2.5.6A。B. Pac
19、I酶切鉴定：Pac I酶切小量提取的重组质粒，酶切反应体系如下： Buffer重组质粒DNA（1 g）6.5 L0.2 LPac I酶离心收集反应液，37酶切5 h后，65孵育20 min，使酶失活；取4 L酶切产物，加2 L 上样缓冲液，0.8%含EB琼脂糖凝胶进行检测，100 V 电泳1 h后凝胶成像观察，以空穿梭质粒以骨架质粒的重组质粒为对照。C. 测序：上述鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，与GenBank比对后，把测序正确的质粒命名为pAd-SOCS2。4.2.7 大量pAd-SOCS2的获得和Pac酶切线性化BJ5183中的质粒提取率较低，所以将pAd-SOCS2转化DH5，
20、步骤详见4.2.3。从Kan（100 g/mL）平板上挑取单克隆，于含Kan（100 g/mL）的100 mL LB液体培养基中37 250 rpm摇菌。待培养基浑浊后，取800 L菌液加200 L 80%甘油冻存，其余菌液全部依照步骤4.2.4提取质粒pAd-SOCS2，再用Pac酶大量酶切重组质粒，体系如下：pAd-SOCS275 LPac I（10,000U/mL）3 L55.5 L37孵育8h，以下步骤同4.2.6.2B-F。4.2.8 pAd-SOCS2的包装、扩繁和滴度测定4.2.8.1 细胞株HEK293的复苏与培养A. 取液氮冻存的HEK 293，迅速于37中水浴解冻，期间不断
21、晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；B. 解冻细胞迅速加到7 mL 含10%胎牛血清的DMEM培养液中，7 mL需要提前预热至37，枪头轻轻吹打，无细胞团存在，1300 rpm 离心6 min，弃去上清；C. 向离心管中加2 mL 提前预热到37的含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞使其悬浮，按照5104将细胞接种于培养皿，于恒温37 的5 % CO2培养箱培养；D. 24 h 换液；以后每隔2 d换液一次；细胞密度达90%时传代。4.2.8.2 pAd-SOCS2包装转染前一天，按照每孔4105个HEK 293细胞接种到6孔板，培养24 h后细胞约有70%融合，转染前4 h，用无双抗PBS
22、清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗无血清的优化培养液Opti-MEMI（2 mL/孔）；LipofectamineTM2000作为转染试剂将pAd-SOCS2转染至HEK293细胞，具体步骤依照说明书进行（所有试剂均为一个孔的试剂用量）：A. 用Opti-MEMI优化培养液将4 g质粒稀释至250 L，室温孵育；B. 同样用Opti-MEMI优化培养液将10 L LipofectamineTM2000稀释至250 L，室温孵育5 min；前两步操作不得超过25 min；C. 将孵育的质粒和LipofectamineTM2000混匀，总体积为500 L，整个过程尽量轻柔，混合溶液室温孵育2
23、0 min；D. 将500 L混合液加到培养板的一个孔中，轻轻晃动培养板混匀培养液；E. 37 5 % CO2培养箱培养，6 h后将培养液换为含10%胎牛血清的DMEM培养液；其中6孔板的4个空按上述步骤进行包装，另外两个孔一个为脂质体对照，一个为空白对照。F. 转染24 h后可在荧光显微镜下观察，记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP的表达，观察细胞病变（Cytopathic effect, CPE）情况。转染810 d后形成一般会有蚀斑出现，此时可将细胞刮下，将细胞收集在冻存管中，于-196（液氮中）和37 反复冻融5次，12000 rpm离心5 min，收集的上清液即为病毒原液，直接用于后续细胞
24、感染或于-80 保存，将病毒液命名为Ad-SOCS2。4.2.8.3 Ad-SOCS2的扩繁60mm培养皿培养细胞，待细胞融合至90%时，将培养皿中的培养液换为新鲜的10% FBS DMEM培养液，将300 L病毒原液加到培养皿中，轻轻晃动培养皿，加培养24 h后观察细胞形态和荧光蛋白表达，待细胞病变后收取细胞，1500 rpm离心6 min收集细胞，加病毒保存液，于-196和37 反复冻融五次，离心去除细胞碎片，根据所需病毒量，继续扩繁病毒或进行病毒滴度测定。4.2.8.4 Ad-SOCS2滴度测定按每孔2104个细胞的密度接种HEK293于96孔板中，采用TCID50法和Karbers法测
25、定并计算Ad-SOCS2的病毒滴度。将以倍比（10-110-10）稀释的病毒液感染细胞，每孔加100 L病毒稀释液，培养910d统计细胞的CEP病变。依照Karbers公式即：T=10101+d （s0.5） TCID50 /mL计算病毒得滴度；其中s 是阳性比率之和，也就是所用个稀释度之和。d = log10稀释度= 1 （这是对于10倍的稀释度而言）；并且根据公式：T = 110X TCID50 /mL = 110X 0.7 PFU/mL，可将病毒滴度换为PFU/mL单位。4.2.9 数据统计及分析试验所得数据用SPSS 13.0统计软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检
26、验，数据采用平均值标准差即MeansSD的形式表示。4.3结果与分析4.3.1 SOCS2的克隆提取小鼠皮下脂肪组织的总RNA，反转录获得总cDNA。用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物进行PCR扩增，获得大小约为700 bp的片段（如图4-1A）。凝胶回收试纯化纯化扩增片段（如图4-1B），T-A克隆至p-MD18载体，获得重组质粒p-MD18-SOCS2，将重组质粒送金斯特生物公司测序，测序结果与GenBank中的NM_007706.3序列进行比对，同源性为100%。图4-1 SOCS2基因 PCR及胶回收产物的凝胶电泳分析A.SOCS2基因的PCR产物；B. SOCS2基因的胶回收产物。Fig.4-1 SOCS2 genes electrophoresis analysis of PCR product and gel recovery product .A. PCR product of SOCS2 genes; B. G
