1、选择治疗基因；主要是依据病因和发病学选定，对于某一种疾病治疗基因可以有多种，可通过优化组合来确定，这将有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。选择治疗基因导入系统（包括基因转移载体和基因导入途径）；是基因治疗的核心技术，是基因治疗是否能够进入临床和获得疗效的关键，因而始终是基因治疗的重点和难点。治疗基因的表达。治疗基因、基因传递系统和基因表达系统是构成基因治疗药物的三个组成部分。3基因治疗的原则将治疗性基因以一定的方式高效导入所需部位，并使之在靶细胞中适时适量表达，从而达到治疗疾病的目的，这是最理想的基因治疗模式。其中有几个关键问题：首先是必须分离出含有调节序列的特异性基因； 其次是必
2、须能够获得足够数量携带该基因的载体或/和细胞；第三必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；最后转染入宿主细胞的目的的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。简言之，导入体内基因要特异、稳定、高效、安全并具有可调控性。3.1目的基因的选择用于基因治疗的目的基因选择原则为:（1）该基因的异常是疾病发生的根源；（2）该基因遗传的分子机制清楚；（3）基因已被克隆，一级结构和表达调控机制较为清楚；（4）可在体外操作，而且安全有效；（5）转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。基因治疗中选择的目的基因可以来自染色体基因组。也
3、可以来自互补DNA （ complementary DNA,cDNA）。目前基因治疗研究中所应用的目的基因多数是通过cDNA克隆技术得到的。以恶性肿瘤为例，在基因治疗方案中，所用的基因大致可归为三类：一是细胞因子类；二是杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（HSV-tk）为代表；三是以P53为代表的抑癌基因或癌基因的反义基因类。3.2受体细胞的选择基因治疗选择受体细胞的原则为：（1）最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水平较低；（2）细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长，使有足够的时间进行体外基因操作；（3）离体的细胞要能接受外源基
4、因的转染；（4）细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内。根据疾病的性质、基因治疗的策略，靶细胞可以选择外周血淋巴细胞、骨髓造血干细胞、成肌细胞、成纤维细胞、角质细胞、呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞和神经胶质细胞等。3.3基因表达载体的选择目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必须将目的基因重组于表达载体的合适位置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体有质粒载体（plasmid vector）和病毒载体（viral vector）两大类。质粒载体一般可用物理、化学以及融合法导入靶细胞。为了便于操作，构建的质粒载体不
5、仅包含哺乳动物细胞的表达调控元件，而且也包含了细菌内进行复制的表达元件，因此被称为穿梭载体（shuttle vector ）。目前被广泛应用于哺乳动物的质粒载体有pSV2, pRSV, pcDNA3和pCI载体系列等。这类载体的特点是可插入较大长度的外源基因（10kb以上），有较为广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细胞株，用于ex vivo基因转移。上述载体随着采用的调控序列不同，其表达的效率也不同。病毒载体的构建与质粒载体相似，但进入靶细胞的方式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式进行包装，获得重组的病毒颗粒，再
6、感染靶细胞，以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表达。4基因治疗中有待解决的关键问题基因治疗是一种富有前景的治疗疾病的方法。然而，人类疾病基因治疗的限制主要是转基因方法的潜在风险，相对低效率和靶基因的细胞内稳定性。因此，基因治疗作为一种崭新的治疗手段要想应用于临床，那么就必须解决几个关键的问题。4.1基因转染系统的安全性基因治疗从实验室走向临床面临的第一个问题就是缺乏完善的基因转移载体系统。众所周知，对临床基因治疗而言，安全性尤为重要。1999年患者Jesse Gelsinger 的死亡，为基因治疗抹上了一层阴影。德国的华人科学家及其同事在用反转录病毒基因标记的动物模型中率先观察到白血病
7、诱导作用，2002年法国基因治疗小组在为一名X染色体连锁的严重联合免疫缺陷性疾病（X-SCID ）患者进行临床基因治疗试验后，又发现了白血病样副作用。免疫学毒性也是病毒载体的又一个缺点，另外要注意的是在宿主内的融合转移基因和病毒的长期性影响。例如在一位接受基因治疗临床试验的患者的精子中发现了用于转基因的病毒，这就暗示了基因治疗可能改变患者后代基因的危险。美国国立卫生研究院重组DNA咨询委员会认为，用逆转录病毒为载体插入靶基因至患者细胞内进行基因治疗，可导致白血病发生，其原因是激发了失控的细胞生长，从而致癌。4.2目的基因的有效性目前尝试用于基因治疗试验的目的基因很多，但真正应用于临床的却寥寥无
8、几，其主要原因之二是转基因至体细胞内适当位点的“低效性”。一方面，对于有效的基因治疗的体内应用，反转录病毒滴度仍然太低；另一方面，如果治疗性DNA未能整合入人体染色体，它在细胞内被终止或分解之前只有短时间内产生蛋白质，若想满足长期治疗需要，基因必须被嵌入依然未确定整合的染色体，并随细胞传代。“低效性的其他原因是大部分的基因治疗是非特异的，对少数特异的基因治疗，在选择靶基因修复或敲除之前，需要确定哪一个是缺陷或突变基因；另外，大多数人类疾病是多基因致病（如癌症），因此大部分单个基因转移的基因治疗往往得不到非常满意的效果。随着功能基因组学研究的开展，各种致病基因的发现及各种基因功能的进一步明确，将
9、带动基因治疗的迅速发展。开发结合二个或更多基因的嵌合靶基因和嵌合载体的基因治疗是富有前景的。4.3基因表达的稳定性基因的相对稳定性是保持个体健康的关键，进行基因治疗时，不仅应当保持导入靶细胞或组织的基因自身的稳定性，而且靶基因转入后应能够持续、稳定地表达，从而产生良好的效果。目的基因表达的组织、时序及水平上的严格调控是这类基因治疗进入临床前必需解决的问题。为此，可以采用组织特异性启动子，设计能整合入基因组终末位点的载体，以避免整合至有潜在风险的位点，并使靶基因在特异的靶组织中长期、稳定地表达，从而满足某些疾病（如血友病）的需要。然而，对于I型糖尿病，持续、稳定的基因表达只是取得最终目标的第一步
10、，因为较高或较低的血糖水平对任何患者都是致命的。对糖尿病的一种确切的治疗是在每日变化的食物摄入中保持正常的血糖浓度。因此，稳定的转基因技术以及如何在期望的时间（定时）和适当的水平（定量）转导基因表达系统至靶器官，且靶基因持续、稳定地表达等问题，是基因治疗成功所必须的条件。研究疾病状态下基因表达调控的机制，开发及应用能被病理信号诱导的启动子元件表达载体系统具有临床应用价值。利用体内特定的生理信号实施转染基因生理水平表达的控制可能成为较理想的方法。4.4目的基因转染的靶向性问题早期基因治疗的疾病主要选择如肺囊性纤维化、ADA-SCID等遗传缺陷性疾病，治疗基因导入体内后即使不进行精确的调控也可获得
11、较好疗效。而在用基因治疗其它多种疾病时，对目的产物的需要量要求严格，如果目的基因表达由载体或病毒启动子自发激活，表达不受控制，目的产物表达过度或不适当，不仅对疾病治疗不利，甚至可能引起致命的副作用。对于理想的肿瘤基因治疗，其目的基因的表达应能区别正常组织与恶性组织，但同时对恶性组织的类型无特殊选择性，能在多种癌症和肿瘤组织中表达，即实现所谓肿瘤特异性表达。目前应用于肿瘤试验性基因治疗载体的启动子可高效启动下游基因的表达，但基因表达缺乏选择性。5 基因载体尽管人们对做为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床方案的进展仍然缓慢。问题的关键在于安全和有效的基因导入系统（Gene del
12、ivery system）的开发。目前有许多载体系统，但没有一个载体可以达到安全、高效、靶向地把基因导入体内的靶细胞。不少临床治疗方案失败于不合适的载体。为了使基因治疗能真正替代当前的常规方法，就必须研发安全、高效的基因导入载体。理想的基因导入载体必须具有一些优异性能以便在体内能克服可能遇到的传输障碍，这些可能遇到传输障碍可分为三类：细胞外、细胞内和开发过程中产生的障碍。细胞外传输障碍包括生理盐条件的影响、血清的影响、细胞相关蛋白的影响和免疫系统的影响。所以一个理想的基因传递系统应该具有如下的特征：（1）良好的生物相容性（无细胞毒性和免疫原性，可生物降解）；（2）一定的包装容量，它应能转染长达
13、1000kb的DNA，能与DNA复合形成颗粒；（3）能保护DNA在血液转移过程中不被核酶降解；（4）能够将DNA输送至特定种类的细胞，包括处于静止期的细胞；（5）在细胞水平上，能将DNA送至所需的细胞器；（6）一旦达到合适位置，能释放DNA进行核转位或调节基因表达；（7）能够引起功能蛋白在特定细胞类型的持续表达而且它绝不会导致癌变；（8）制备方便。现有的载体都只能部分满足上述条件，而不能提供所需的全部功能。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。当前主要使
14、用的三种DNA转染系统是，物理转染系统（基因枪、电穿孔和裸DNA直接注射），病毒载体和非病毒人工合成的转染载体。其中物理转染系统只能应用于皮肤、肌肉和肝脏等有限几种组织。因此基因治疗应用的载体主要集中于病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，已被广泛而有效地得到了应用。但是病毒载体存在许多不足，主要体现在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小等。非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20%；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性的多聚物，以及脂质体/多聚物/DNA复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新
15、技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。5.1 病毒载体5.1.1逆转录病毒（retrovirous）载体逆转录病毒是病毒性载体中应用最早、研究相当成熟、目前仍被广泛应用的载体。逆转录病毒较突出的优势是它可以有效地整合人靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座子的方式整合，其基因组不发生重排，外源基因不会受影响。近几年来，人们在增强逆转录病毒的靶向性方面作了许多尝试，并取得了一定成果。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白（envolop env）决定，env来自何种病毒，包装出的逆转录病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。通过改变G蛋白可以改善载体细
16、胞靶向性。如用水泡性口炎病毒的-蛋白包装逆转录病毒基因组产生假病毒，可以拓展逆转录病毒的靶细胞范围并赋予病毒颗粒新的特性。为提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，还可以在原来的病毒env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体（bcFv）。如Martin等设计的特异靶向黑色素瘤细胞的逆转录病毒，在病毒包被糖蛋白的表面结构域上连接特异识别高分子黑色素瘤相关抗原（HMW-MAA）的bcFv，90%的人黑色素瘤细胞高水平表达HMW-MAA这一穿膜分子，而绝大多数成人组织不表达。改造过的载体在bcFv的导向下与肿瘤细胞结合，大大提高了载体靶向的特异性。慢病毒（lentivirus）
17、也属于逆转录病毒家族，是一类很有前途的基因转移载体。它既可以感染分裂细胞又可感染非分裂细胞。该病毒载体能整合入靶细胞基因组、不需要反复转导细胞。最为人们熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV），复制缺陷型HIV可被用于基因转移。HIV具有简单逆转录病毒的3个基因（gag、pol和env），此外还有6种辅助蛋白基因。以HIV-1为例，其进入细胞需要结合两种细胞表面受体，其中之一为固定成分，另一种为可变成分趋化因子受体。这种趋化因子受体可能是CCKR4（主要是T细胞表达）或CCDR5（主要是巨噬细胞表达）。利用HIV-1的这一特性可使基因转移具有特殊的靶向。虽然使用缺陷型病毒时靶细胞不表达病毒蛋白，
18、但人们对其安全性还存有一定疑虑。目前，科学家们正尝试在不影响病毒功能的前提下尽量删除病毒序列以建立更加安全的慢病毒载体。5.1.2腺病毒（Adenovirus，AV）载体腺病毒也是转基因治疗中较常用的一种有效运载工具。它的宿主范围广，分裂和非分裂细胞均能感染。与逆转录病毒家族载体不同，腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组中，而是以附加体的形式存在，不随宿主细胞分裂而复制，是典型的一过性表达载体，治疗中有时需要反复转导。这一特性对于免疫基因治疗来说是非常有利的，用腺病毒载体将不会导致象能整合的载体那样，使用后出现对免疫系统缠绵持久的刺激。腺病毒转录单位密集而复杂，重组困难，仅限于特定的区域，一般
19、是在E1、E2A、E3和E4。第一代腺病毒载体通常以转移基因取代E1A和E1B，但是这种载体有明显的缺陷：包装能力较低，细胞毒性较强，易引发免疫反应。近年来，在增大载体容量、降低细胞毒性、减弱宿主免疫反应等方面的研究有了很大进展，切除了E1和E3的第二代载体，延长了转移基因在体内的表达时间并降低了细胞毒效应。虽然重组腺病毒载体应用日益广泛，但有几个主要缺陷仍需改进：腺病毒载体介导的基因表达通常都是短期的；在体内引发强的免疫和炎症反应；单次大剂量应用，会激发抗病毒的中和抗体产生，降低系统应用的效率；特异性较低。在这些领域，国外进行了大量研究。有人切除了腺病毒的E1、E2和E4基因后，发现能避免其
20、在宿主细胞中表达免疫原性病毒蛋白。Belousova等报道，通过在衣壳上嵌合CD40配体，可以使腺病毒载体高效感染CD40阳性的树突状细胞和肿瘤细胞，这一特点可用于遗传性免疫疾病和肿瘤的基因治疗。Kreppel等构建的高容量腺病毒载体（HC-Ad）可以在大鼠视网膜色素上皮细胞中持续表达6个月，而有人利用神经元特异的强启动子，使重组腺病毒载体在脑海马回中的表达时间可长达9个月。总之，腺病毒由于其本身的生物学特点，有其独特的优势，加强对腺病毒载体的基础研究，一定会促进这一基因转移载体的发展和完善。5.1.3腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体AAV是一种缺陷病毒，
21、不能进行独立复制，只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疮疹病毒、痘苗病毒存在的情况下，才能进行最佳复制，产生新的病毒颗粒，否则只能进行潜伏感染。AAV载体具有安全，宿主范围广，可以长期表达转基因产物的特点，使它在基因治疗领域得到广泛的应用。现发现AAV有六种血清型，其中AAV-2研究得最为清楚，其基因组是长4680 bp的单链线状DNA，两侧为两个长145bp的回文序列，称反向末端重复序列（ITR），呈T形发夹样结构。ITR为病毒DNA复制，包装，“拯救”所必需的唯一顺式作用元件。AAV作为基因治疗载体的优势主要有：AAV是一种人源性的病毒，对人体无致病性，免疫反应轻微；可定点整合至人的19号染色体，
22、并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；AAV介导的基因转移系统可使外源基因持续稳定表达，并可受到周围基因的调控；AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞；AAV转移系统具有较好21的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存。但由于存在利用效率低的问题，目前科研工作者进行了大量关于增强AAV基因载体效应的研究，取得了可喜的成果。如Gao等用含有AAV的rep/cap基因盒的质粒感染A549细胞获得K209细胞，代替293细胞，使细胞内rep/cap基因的表达扩增1000倍，增加了r-AAV的产量。对不同的细胞，AAV载体的
23、转染效率存在差异。Halbert等报道，AAV-6载体对肺气道上皮细胞的转染率显著大于AAV-2载体，最高可达80%。用rAAV进行基因治疗若有轻度免疫反应，将影响转染效率。人群中约有50%60%的人血清中带有抗AAV-2的抗体，其中有18%7.5%为中性抗体，这些抗体的存在给rAAV的成功转导增加一定的难度。Bartlett等对AAV表面进行化学修饰后，成功地转染了非病毒许可的人巨核细胞系。经过多年的研究，AAV载体在多种组织都进行了成功的转染，如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和气道上皮等组织，未发现对机体有致病性。5.1.4单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体
24、单纯疱疹病毒和的基因组都是大型线性DNA，约150 kb长，包含7080个基因。野生型病毒既可以感染细胞并裂解之，也可以在某些细胞类型如神经元中进入潜伏期。除对神经细胞有亲和性之外，单纯疱疹病毒还能感染多种细胞，包括肌肉、肿瘤、肺、肝和胰岛细胞，病毒滴度很高，可达108109 PFU/ml。它不整合到宿主染色体上，但可在神经细胞核内持续存在。早期（immediate early，IE）基因ICP4基因突变后病毒就丧失了自主复制能力，只能在辅助细胞的帮助下进行增殖，这就是最初的单纯疱疹病毒载体。单纯疱疹病毒载体的一大优点是载体容量很大，为各种病毒载体之最，可容纳高达50 kb的外源DNA，因此可
25、以同时装载多个目的基因。虽然单纯疱疹病毒载体的ICP4基因突变了，但是，其它IE基因仍然能够表达，而表达产物对许多类型的宿主细胞都有毒性，且在活体试验中引起严重的免疫反应，从而限制了这种载体在基因治疗中的应用。最近，有人构建了缺失ICP4、22和27的新型载体，可以降低对细胞的毒性水平，并延长基因的离体和活体表达时间。这种载体如果能够去除所有IE基因，同时建立起相应的辅助细胞系，那么将很有可能广泛应用于临床。另一种方法是，将原来载体结构上的所有单纯疱疹病毒结构基因全部去除，只保留了复制起点和包装信号顺序，再装上目的基因，然后与带有单纯疱疹病毒基因组但缺失了包装顺序的粘粒（cosmid）共转染宿
26、主细胞。得到的病毒由于不带有任何病毒基因，因此也就不会产生由于单纯疱疹病毒蛋白低水平表达所带来的毒性反应。这种载体的致命缺点是病毒滴度太低，只有106107 PFU/ml，约为改造前的1%。与其它病毒载体不同的是，在重组单纯疱疹病毒载体上使用外源启动子效果很差。绝大多数非单纯疱疹病毒来源的启动子插入载体后，所控制的目的基因表达时间都很短，只有一周左右。通过对病毒生活史中的潜伏期的研究，人们正在努力构建一个经过修饰的潜伏期相关转录启动子（latency-associated transcript promoter，LAP），以保证外源基因能够得到长期稳定表达。未经修饰的LAP控制基因转录也是暂时
27、的，但在引入一些可诱导元件后，可以使外源基因获得长期的甚至是细胞专一性的稳定表达。由于单纯疱疹病毒具有天然的向神经性，这种载体在基因治疗神经系统疾病方面得到广泛的应用。以治疗帕金森氏病（PD）为例，这种载体要想在基因治疗PD临床试验中得到广泛应用，还要作出两方面的改进。第一，载体要能够兼容一系列有神经细胞和胶质细胞特异性的启动子，从而能够控制目的基因进行精确的细胞特异性表达。要做到这一点，可能需要引入染色质活化DNA元件，如LCRs或MARs。第二，要去除载体的细胞毒性。关于这一点，前面已有介绍，这里不再重复。5.1.5其它病毒载体除了以上病毒载体外，流感病毒、副流感病毒、痘病毒、新城疫病毒等
28、也在不程度上得到研究和应用。综上所述，病毒是非常有效的转基因载体，然而，病毒载体的使用受限。缺陷在于，病毒载体的结构会产生免疫反应或细胞毒性。虽然复制缺损型结构被大量用于疾病的治疗，但是危险性在于产生致病的缺损型病毒。逆转录病毒仅被用于有丝分裂系统，而这种病毒又会引起基因组的致癌反应。重复使用病毒载体会诱导免疫反应，从而削弱转基因的表达效果。非病毒载体可以克服病毒载体的缺陷，具有低细胞毒性和低免疫反应等。此外，非病毒载体没有基因尺寸方面的限制，而病毒载体被限制在6-8 kbase。考虑到病毒载体的这些局限性，对非病毒载体的研究愈来愈引起人们的关注。5.2非病毒载体由于在不同的试验与治疗方面，非
29、病毒载体系统表现出多种潜在的优越性，越来越多的实验室选择非病毒载体基因转移系统作为研究方向。将非病毒载体大体分为两种，物理方法途径和化学方法途径。5.2.1裸DNA介导的基因转移裸DNA是最简单的一种基因治疗形式。它是由编码生物活性物质的基因及作为其载体的质粒组成。1990年，Wolff JA等人发现，当将纯化的质粒DNA直接注射到小鼠骨骼肌细胞中后，该基因能够表达，并且在接种两个月后，编码的酶仍然具有生物学活性。这是人们首次发现DNA免疫现象。自此，许多人致力于开发将可编码蛋白抗原的质粒直接导入动物组织，诱导动物的免疫系统对所表达的蛋白质产生体液免疫或细胞免疫，这也就是我们常说的基因疫苗。除了导入编码蛋白质抗原的基因外，也可以导入编码其他具有药理活性的基因分子，如表达促红细胞生成素（EPO），以用于恶性肿瘤的治疗。裸DNA在体外不能转染细胞，但在体内原位注射时（尤其是肌肉和皮肤），它能有较高的转染效率。但至今人们对裸DNA到底是如何转染细胞，在体内发挥机制的具体过程仍不清楚。但人们发现，当向小鼠门静脉或尾静脉以较大体积注射入质粒时，能引起较高效率表达，这为我们利用裸鼠研究基因功能提供了一种简单手段。裸DNA作为
