1、分子生物学技术生物实验室安全常识（废液处理篇）生物谷 生物谷编者按：我们的生物实验室存在多少危险？生物实验对我们操作人员造成了怎样的危害？实验室工程菌外流对我们环境的影响有几多？ 这些平时并不引起我们注意的隐患也许会给我们自身健康，或者环境带来长远的影响，因此生物通网站联合遗传、中国生物工程杂志、生命世界杂志开展2007赛默飞世尔中国生物实验室安全现状调查活动，提出警示，珍惜生命！此次活动的现状调查报告将发于相关部门，提出宝贵意见的读者将有机会获得精美礼品。实验室的污染主要有生物性污染和化学污染两种。如按形态分则可大致分为废水、废气和固体污染物三种。其中生物污染包括生物废弃物污染和生物细菌毒素
2、污染，如血液、尿、粪便、各种电泳液、特种生物试剂等。而化学污染则包括有机物污染和无机物污染。除此以外，还有部分实验室存在放射性污染。在此次赛默飞世尔中国生物实验室安全调查活动中，从现有调查结果中，我们惊讶的发现许多生物实验室存在严重的污染问题，而其中又以废液废品的处理为最，大部分实验室在进行生物实验过程中产生的大量高浓度含有害微生物的培养液、培养基，未经适当的灭菌处理而直接外排，而且许多实验室的下水道与附近居民的下水道相通，污染物通过下水道形成交叉污染，最后流入河中或者渗入地下，时间长了将造成不可估量的危害。由于目前虽然国家环保总局将各类实验室纳入环保监管范围，但是许多实验室仍然处于监控真空状
3、态，缺乏规章制度、缺乏实验室污染控制的经费投入、缺乏对实验室的监管等各种原因导致了实验室成为了污染源，对环境造成了威胁，这些种种都需要社会各界的共同关注。生物实验室产生的废液污染主要是化学性污染和生物性污染，另外还有放射性污染，化学性污染包括有机物污染和无机物污染。有机物污染主要是有机试剂污染和有机样品污染。在大多数情况下，实验室中的有机试剂并不直接参与发生反应，仅仅起溶剂作用，因此消耗的有机试剂以各种形式排放到周边的环境中，排放总量大致就相当于试剂的消耗量。日复一日，年复一年，排放量十分可观。有机样品污染包括一些剧毒的有机样品，如农药、苯并()芘、黄曲霉毒素、亚硝胺等。无机物污染有强酸、强碱
4、的污染，重金属污染，氰化物污染等。其中汞、砷、铅、镉、铬等重金属的毒性不仅强，且有在人体中有蓄积性。 生物性污染包括生物废弃物污染和生物细菌毒素污染。生物废弃物有检验实验室的标本，如血液、尿、粪便、痰液和呕吐物等；检验用品，如实验器材、细菌培养基和细菌阳性标本等。生物实验室的通风设备设计不完善或实验过程个人安全保护漏洞，会使生物细菌毒素扩散传播，带来污染，甚至带来严重不良后果。2003年非典流行肆虐后，许多生物实验室加强对SAS病毒的研究，之后报道的非典感染者，多是科研工作者在实验室研究时被感染的。在对这些污染处理的时候，需要注意以下几个方面： 废液的浓度超过规定的浓度时，必须进行处理。但处理
5、设施比较齐全时，往往把废液的处理浓度限制放宽。 最好先将废液分别处理，如果是贮存后一并处理时，虽然其处理方法将有所不同，但原则上要将可以统一处理的各种化合物收集后进行处理。 处理含有络离子、螯合物之类的废液时，如果有干扰成份存在，要把含有这些成份的废液另外收集。下面所列的废液不能互相混合：过氧化物与有机物；氰化物、硫化物、次氯酸盐与酸；盐酸、氢氟酸等挥发性酸与不挥发性酸；浓硫酸、磺酸、羟基酸、聚磷酸等酸类与其它的酸；铵盐、挥发性胺与碱。 要选择没有破损及不会被废液腐蚀的容器进行收集。将所收集的废液的成份及含量，贴上明显的标签，并置于安全的地点保存。特别是毒性大的废液，尤要十分注意。 对硫醇、胺
6、等会发出臭味的废液和会发生氰、磷化氢等有毒气体的废液，以及易燃性大的二硫化碳、乙醚之类废液，要把它加以适当的处理，防止泄漏，并应尽快进行处理。 含有过氧化物、硝化甘油之类爆炸性物质的废液，要谨慎地操作，并应尽快处理。 含有放射性物质的废弃物，用另外的方法收集，并必须严格按照有关的规定，严防泄漏，谨慎地进行处理。另外不同种类的废液等污染也要进行不同的处理：一、化学类废物 一般的有毒气体可通过通风橱或通风管道，经空气稀释排出。大量的有毒气体必须通过与氧充分燃烧或吸收处理后才能排放。 废液应根据其化学特性选择合适的容器和存放地点，通过密闭容器存放，不可混合贮存，容器标签必须标明废物种类、贮存时间，定
7、期处理。一般废液可通过酸碱中和、混凝沉淀、次氯酸钠氧化处理后排放，有机溶剂废液应根据性质进行回收。 1.含汞废液的处理 排放标准3：废液中汞的最高容许排放浓度为0.05mg/L(以Hg计)。 处理方法：硫化物共沉淀法：先将含汞盐的废液的pH值调至8-10，然后加入过量的Na2S，使其生成HgS沉淀。再加入FeS04(共沉淀剂)，与过量的S2-生成FeS沉淀，将悬浮在水中难以沉淀的HgS微粒吸附共沉淀然后静置、分离，再经离心、过滤，滤液的含汞量可降至0.05mg/L以下。2 还原法：用铜屑、铁屑、锌粒、硼氢化钠等作还原剂，可以直接回收金属汞。 2.含镉废液的处理 氢氧化物沉淀法：在含镉的废液中投
8、加石灰，调节pH值至10.5以上，充分搅拌后放置，使镉离子变为难溶的Cd(OH)2沉淀分离沉淀，用双硫腙分光光度法检测滤液中的Cd离子后(降至0.1mg/L以下)，将滤液中和至pH值约为7，然后排放。 离子交换法：利用Cd2+离子比水中其它离子与阳离子交换树脂有更强的结合力，优先交换 3.含铅废液的处理 在废液中加入消石灰，调节至pH值大于11，使废液中的铅生成Pb(OH)2沉淀然后加入Al2(S04)3(凝聚剂)，将pH值降至7-8，则Pb(OH)2与Al(OH)3共沉淀，分离沉淀，达标后，排放废液。4.含砷废液的处理 在含砷废液中加入FeCl3，使FeAs达到50，然后用消石灰将废液的pH
9、值控制在8-10。利用新生氢氧化物和砷的化合物共沉淀的吸附作用，除去废液中的砷。放置一夜，分离沉淀，达标后，排放废液。5. 含酚废液的处理 酚属剧毒类细胞原浆毒物，处理方法：低浓度的含酚废液可加入次氯酸钠或漂白粉煮一下，使酚分解为二氧化碳和水。如果是高浓度的含酚废液，可通过醋酸丁酯萃取，再加少量的氢氧化钠溶液反萃取，经调节pH值后进行蒸馏回收处理后的废液排放。 6. 综合废液处理 用酸、碱调节废液PH为3-4、加入铁粉，搅拌30min，然后用碱调节p H为9左右，继续搅拌10min，加入硫酸铝或碱式氯化铝混凝剂、进行混凝沉淀，上清液可直接排放，沉淀于废渣方式处理。 二、生物类废物 生物类废物应
10、根据其病源特性、物理特性选择合适的容器和地点，专人分类收集进行消毒、烧毁处理，日产日清。 液体废物一般可加漂白粉进行氯化消毒处理。固体可燃性废物分类收集、处理、一律及时焚烧。固体非可燃性废物分类收集，可加漂白粉进行氯化消毒处理。满足消毒条件后作最终处置。 1.一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋内集中烧毁。 2.可重复利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有效氯溶液浸泡2-6h然后清洗重新使用，或者废弃。 3.盛标本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗涤剂及流水刷洗、沥干；用
11、于微生物培养的，用压力蒸汽灭菌后使用。4.微生物检验接种培养过的琼脂平板应压力灭菌30min，趁热将琼脂倒弃处理。 5.尿、唾液、血液等生物样品，加漂白粉搅拌后作用2-4h，倒入化粪池或厕所。或者进行焚烧处理。 三、放射性废弃物 一般实验室的放射性废弃物为中低水平放射性废弃物，将实验过程中产生的放射性废物收集在专门的污物桶内，桶的外部标明醒目的标志，根据放射性同位素的半衰期长短，分别采用贮存一定时间使其衰变和化学沉淀浓缩或焚烧后掩埋处理。 1.放射性同位素的半衰期短(如：碘131、磷32等)的废弃物，用专门的容器密闭后，放置于专门的贮存室，放置十个半衰期后排放或者焚烧处理。 2.放射性同位素的
12、半衰期较长(如：铁59、钻60等)的废弃物，液体可用蒸发、离子交换、混凝剂共沉淀等方法浓缩，装入容器集中埋于放射性废物坑内。除了这些需要注意的事项以外，处理废液等污染也需要一些安全可靠的产品，目前国际上公认的安全废液处理，回收等方面的产品来自赛默飞世儿公司，这在之前驻外观察员特稿美国与加拿大生物实验室废弃物处置 文中也可以看出来。这些废液处理小器具包括： /P第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的
13、稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Rela
14、xed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分
15、配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制
16、性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。从细菌中分
17、离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复
18、性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 第二节 材料、设备
19、及试剂 一、材料 含pBS的E. coli DH5或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。 二、设备 微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体
20、培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20,每一小份一经使用后便予丢弃。5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4冰箱。 6、 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L E
21、DTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。7、溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。 8、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装
22、成小份保存于-20。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强
23、的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、 TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH
24、8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。 第三节 操作步骤 一、 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS的DH5菌种接种在LB固体培养基(含50g/ml Amp)中, 37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50g/ml Amp)中,37振荡培养约12小时至对数生长后期。 二、 质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。（
25、一）、煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4下12000离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。注意 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解
26、效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。（二）、 碱法 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10
27、分钟,4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。注意 1
28、. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 （三）、Wizard少量 DNA 纯化系统 Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂
29、包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。 1、 1-3ml过夜培养细胞液4下 12000g离心1-2分钟。 2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200l 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。 3、 加200l 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。 4、加200l 中和液,颠倒离心管数次。 5、4下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。 6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。
30、 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。 8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。 9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50l TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后，4下12000g离心20秒。 11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4或-20冰箱。 注意 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37水浴处
31、理10分钟。三、质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。 5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。 6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。7、4下5000g离心15分钟。 8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37水浴2
